形态学实验报告

小鼠腹水型肝癌淋巴道转移实验摘要：【目的】1通过可移植性小鼠腹水肝癌淋巴道转移实验，从感性上认识肿瘤侵袭与淋巴道转移的生物学特性，了解肿瘤动物实验模型建立的过程及意义。2进一步了解动物尸体解剖、组织取材、染色的过程。3强化科研思维的培养及实验技能的训练。【方法】获取小鼠腹水型肝癌淋巴道高转移细胞株(Hca—F)后经615小鼠右腋皮下皮下接种10只，固定，切片，染色，镜下观察转移组织及淋巴结转移的分布与转移率。【结果】小鼠存活率70%，小鼠肝癌腹水型细胞株Hca-F淋巴结转移率100％分布于颈部淋巴结，腹股沟淋巴结，锁骨上淋巴结。关键词：淋巴道转移肝癌Hca-F小鼠肝癌高复发转移率已成为制约其提高预后的瓶颈，因此研究肝癌转移机制具有重要意义鉴别肿瘤细胞不同转移能力的特征，是肿瘤诊断、治疗和预后判定的首要问题．淋巴道转移是上皮来源的恶性肿瘤的主要转移途径，临床上已将区域性淋巴结转移视为影响恶性肿瘤患者预后的最重要因素。1990年大连医学院病理学教研室从小鼠腹水型肝癌淋巴道转移细胞系Hca—F25／L中分离出具有淋巴道不同转移能力的两株瘤细胞，其中高转移克隆株Hca—F(16A．3一F_3)淋巴结转移率为78．6％一89．4％被广泛应用于肿瘤淋巴道转移机制研究及药物筛选。对深入研究肝癌转移和复发机制，寻求有效的抗转移和复发的治疗措施具有重要现实意义．1材料与方法：1.1实验材料：1.1.1细胞系：高转移力小鼠腹水型肝癌细胞，由大连医科大学病理教研室建株并保存。1.1.2实验动物：近交系615小鼠，雌雄兼用，6—8周龄，体重18—22g，由大连医科大学实验动物中心提供。1.1.3主要仪器及器皿：搪瓷盆、温度计、离心管、1ml注射器、手术刀、眼科手术剪、眼科手术镊、乳胶手套、生理盐水、1%来苏儿溶液、75%酒精棉、10%甲醛固定液等。1.2研究方法细胞系获取。从液氮罐中取出高转移力小鼠腹水型肝癌细胞塑料冻存管，立即放入40度的温水中，一分钟内使冻存液全部融化，拉力机送入无菌室中。取出细胞悬液放入离心管中，有生理盐水洗涤2次，离心，弃上清，在加1ml生理盐水吹打均匀。向小鼠腹腔内接种0.2mlHCa-F细胞悬液，于第6天无菌条件取腹水。1.3615小鼠脚垫接种肿瘤细胞。取615小鼠癌性腹水0.1ml，接种于615小鼠脚垫上。定期观察肿瘤生长及淋巴结肿大情况。四周后处死全部小鼠，取瘤体及相关淋巴结，同时观察肺、肝、肾等器官。将上述组织固定于10%甲醛固定液中，石蜡包埋制片，HE染色，显微镜检查。4.组织取材。将皮下瘤体、淋巴结、肺、肝、肾选取病变部位，切成厚2—3mm的小于2cm×1cm大小的组织块，10%中性甲醛固定。小块组织一般固定数小时，较大标本需固定24—48小时。经冲洗（用递升浓度的酒精等）、透明（用二甲苯等）、浸蜡（用石蜡），然后用石蜡将组织包埋成蜡块，再经切片机切片和染色制成切片。一般常规作苏木精-伊红染色。1.4组织取材。将皮下瘤体、淋巴结、肺、肝、肾选取病变部位，切成厚2—3mm的小于2cm×1cm大小的组织块，10%中性甲醛固定。小块组织一般固定数小时，较大标本需固定24—48小时。经冲洗（用递升浓度的酒精等）、透明（用二甲苯等）、浸蜡（用石蜡），然后用石蜡将组织包埋成蜡块，再经切片机切片和染色制成切片。一般常规作苏木精-伊红染色。1.5切片脱色。石蜡切片法、HE染色法。脱水程序及时间：组织固定，冲洗，然后：1.5.1脱水。以下列顺序进行：60%酒精30分钟→80%酒精1—2小时→95%酒精2—4小时或过夜→95%酒精2—4小时→100%酒精2—4小时→100%酒精2—4小时或过夜。1.5.2透明：二甲苯I30—45分钟；二甲苯Ⅱ30—45分钟。1.5.3浸蜡。蜡碗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（各30—45分钟）；包埋。1.5.4修蜡块。修蜡块，贴号。1.5.5切片。1.5.6烘烤。烘烤切片60—70摄氏度，1小时。1.7染色。HE切片染色程序与方法:1.7.1切片脱蜡水洗：将烘干的切片浸入二甲苯Ⅰ、Ⅱ各5-10分钟。无水酒精3-10分钟（消除二甲苯）→95%酒精1-3分钟→80%酒精1-3分钟→70%酒精1-3分钟→50%酒精1-3分钟→自来水冲洗5分钟以上（洗去切片上的酒精，切片透明）→蒸馏水清洗（防止污染苏木精染液）。脱蜡是水华过程，目的是通过酒精的缓冲作用，易于水洗与染色。因为染剂是谁，从无水酒精直接放入染液中，容易引起激烈的扩散作用，造成切片漂浮脱落或损伤组织。而经各级浓度酒精缓冲后即可避免发生这种现象。1.7.2HE染色：苏木精-伊红染色是先用苏木精将组织切片适当的果然，经水洗后再用盐酸酒精分化，弱碱性水溶液显蓝。使胞核呈明显的蓝色，胞质及背景无色。再经水洗后用伊红染胞质，染成深浅不同程度的粉红色至红色。苏木染色（染核）5-15分钟→自来水冲洗3-5分钟→0.5%盐酸酒精溶液分化数秒钟→自来水洗1-5分钟→弱碱性水溶液显蓝30-60秒→自来水冲洗5-10分钟→蒸馏水洗1-2次→伊红1分钟→蒸馏水洗1-2次。1.7.3脱水、透明、封固：脱水、透明的目的是使存留在切片上的水分及漂浮的染色液全部除净，经透明剂的作用后，将脱水剂清除出来，使切片产生适宜的折光率。最后用盖玻片及封固剂封固，便于观察和长期保存。80%酒精30-40秒→95%酒精30-60秒→无水酒精Ⅰ1-5分钟→污水酒精Ⅱ1-5分钟→二甲苯Ⅰ1-5分钟→二甲苯Ⅱ1-5分钟→中性树胶封固。2结果：2.1Hca—F的形态学特点及淋巴结转移率将HCa—F细胞接种于小鼠腋窝皮下，2ld后小鼠右侧腹股沟淋巴结肿大，右腋皮下接种部位形成局部移植瘤．质硬，灰白色。局部移植瘤组织病理学改变见图1，可见大的多边形细胞呈片状分布，大小不等，具有明显的异型性，并可见多核瘤巨细胞。部分细胞呈片状坏死改变，血管间质少。右侧腹股沟肿大淋巴结组织(HCa—F)病理学改变见图2，可见淋巴结中大的多边形细胞呈片状分布，异型性明显，与原位移植瘤形态相似，表明此淋巴结中的肿瘤组织是移植瘤发生了淋巴道转移的结果，且转移率为100%。2.2淋巴结转移的分布主要分布于腋窝淋巴结、腹股沟淋巴结，锁骨上淋巴结及颈部淋巴结有累及。2.3肺、肝、肾；大体：未见异常ＬＭ：未见到组织结构和细胞的异型性。表明此种肿瘤未经血道转移。讨论：1.为什么选用615小鼠做小鼠腹水型肝癌高淋巴道转移细胞株的移植瘤实验？中国医学科学院血液学研究所1961年5月用本所饲养的昆明种白化雌性小鼠和由前苏联引进的C57BL血研黑色雄性近交系小鼠杂交而得的第一代615近交系小鼠，用杂交第一代严格按照同胞兄妹交配的原则连续繁殖20代以上得到的一系棕色小鼠。615小鼠淋巴系统比较发达且有许多近交系，部分近交系有其特定的自发性肿瘤，可利用其自发肿瘤与人体肿瘤的相似之处做为动物模型进行肿瘤发生、发展和治疗的研究。同时，对于胸腺严重缺陷的裸小鼠可，是研究人类肿瘤生长发育、转移和治疗的绝佳动物。2.为什么选用615小鼠的右腋皮下作为肿瘤细胞的接种部位?由于此处的淋巴结相对较多，有丰富的血液循环，小鼠右腋皮下腋下作为肿瘤细胞的接种部位也是肿瘤容易转移的原因。3.恶性肿瘤细胞转移的可能机制有哪些?①淋巴道转移:恶性肿瘤侵入淋巴管后，随淋巴流首先到达局部淋巴结。局部淋巴结发生转移以后，可继续转移至下一站的其他淋巴结，最后，可经胸导管入血再继发血道转移。值得注意的是，有的肿瘤可以逆行转移或者越过相应的引流淋巴结发生跳跃式转移。②血道转移:恶性肿瘤细胞侵入血管后可随血流到达远处器官继续生长，形成转移瘤。血道转移的途径与血栓栓塞的过程相似，即侵入体循环静脉的恶性肿瘤细胞经右心到肺，在肺内形成转移瘤。此外，侵入胸、腰、骨盆静脉的恶性肿瘤细胞也可以通过吻合枝进入脊椎静脉丛。③种植性转移：体腔内器官的恶性肿瘤蔓延至器官表面是，其肿瘤细胞可以脱落，并向播种一样种植在体腔内各个器官的表面，形成多数的转移瘤，这种方式亦称为播种。值得注意的是，手术也可能造成医源性种植性转移。结论：高转移力的小鼠腹水型肝癌细胞可以经淋巴道转移。图1：HCa-F接种于615小鼠右腋皮下的移植瘤组织学图片图2：右侧腹股沟肿大淋巴结组织(HCa—F)病理学改变参考文献[1]张宇虹,唐建武,王绍清等.磷酸化JNK在小鼠腹水型肝癌高、低淋巴道转移株中表达研究[J].中国实验诊断学,2008,12(11):1347-1349.DOI:10.3969/j.issn.1007-4287.2008.11.003.[2]张宏颖,刘春平,唐建武等.姜黄素对小鼠腹水型肝癌高淋巴道转移细胞株(HCa-F)生物学行为的影响[J].中草药,2005,36(11):1663-1667.DOI:10.3321/j.issn:0253-2670.2005.11.030.[3]孙明忠,刘淑清,唐建武等.鼠肝癌淋巴道转移细胞模型的蛋白质组学研究[J].高等学校化学学报,2009,30(3):517-524.DOI:10.3321/j.issn:0251-0790.2009.03.017.[4]宋波,王波,崔晓楠等.应用表达芯片筛选小鼠肝癌淋巴道转移相关基因[J].临床与实验病理学杂志,2005,21(6):701-706.DOI:10.3969/j.issn.1001-7399.2005.06.017.[5]张宏颖,唐建武,朱文婷等.小鼠腹水型肝癌淋巴道高转移细胞系HCa-P/L6细胞模型的建立及其药物敏感性的评价[J].大连医科大学学报,2008,30(4):297-304.