微生物检验第十二章真菌.

真菌真菌有细胞壁、典型细胞核，不含叶绿素，不分根、茎、叶的真核细胞型微生物。细胞质内有完整的细胞器。原核细胞型微生物与真核细胞型微生物比较原核细胞型微生物真核细胞型微生物细胞核结构核膜无有核仁无有分裂方式主要以二分裂有丝分裂，减数分裂细胞质结构质膜常缺乏固醇常有固醇内膜较简单，有中介体复杂，有内质网和高尔基体核糖体70S80S呼吸系统质膜或中介体线粒体•Dimorphism（二相性真菌）机体内寄生37℃UnicellularMulticellular含动物蛋白培养基yeast沙保氏培养基25℃普通培养基25℃mold真菌繁殖结构，一条菌丝可生成多个孢子MorphologyofSpore孢子芽胞作用真菌繁殖结构细菌休眠结构，抵御不良环境低抗力不强，加热60~70℃短时间即可死亡强，有的可耐100℃数小时Categoriesofsporesexualspore:asexualspore分生孢子叶状孢子孢子囊孢子芽生孢子厚膜孢子关节孢子大分生孢子小分生孢子芽生孢子厚膜孢子关节孢子孢子囊孢子标本（1）皮肤的角质性物质（2）各种分泌物和排泄物（3）血液和体液（4）脓汁及渗出物（1）采集的标本要适宜（2）在用药前采集标本（3）采集的标本量要足（4）严格无菌操作（5）采集的标本立即送检注意1.镜检真菌形态2.真菌抗原检测3.真菌分离培养与鉴定4.真菌核酸检测5.真菌毒素检测实验室检验•癣病标本多用KOH湿片检查法意义③判断某些真菌种的致病性等,如皮肤癣菌、曲霉等。直接镜检阳性表示：①有诊断意义。②看到的就是真菌的形态，可确定某些致病性真菌的属或种。②有假阳性结果。局限性：①阴性结果不能排除真菌感染；常用的染色方法•常用的染色方法有革兰染色、瑞氏染色、荧光染色，乳酸酚棉蓝染色、还有墨汁负染色等。•对检测骨髓和外周血中的荚膜组织胞浆菌，需作瑞氏染色或姬氏染色后镜检。•检测病人脑脊液标本中新生隐球菌，需作墨汁负染色后检查，背景为黑色，新生隐球菌和荚膜不着色（二）、真菌抗原检测•白假丝酵母菌甘露聚糖抗原、隐球菌多糖荚膜抗原、组织胞浆菌循环多糖抗原•常用的方法有胶乳凝集试验、ELISA、半定量放射免疫法（三）、真菌的分离培养真菌的培养特点：三低两高真菌培养是目前准确鉴定真菌的可靠方法平皿培养大试管培养玻片培养①菌落性质：酵母菌还是霉菌②菌落大小：病原性真菌菌落小，而条件致病性真菌菌落大④致病性真菌菌落下沉，有时使培养基开裂；污染性真菌菌落不下沉,很少引起开裂。③菌落颜色病原性真菌颜色淡，污染真菌颜色深；菌落的性状是鉴别真菌的重要特征真菌鉴定1.糖(醇)类发酵试验2.同化碳源试验3.同化氮源试验菌种鉴定是一个复杂过程，仅观察菌落形态是远远不够的，还需作生化反应，分子生物学鉴定，必要时将菌种送有关单位鉴定。核酸检测毒素的检测动物试验1.多烯类抗生素，如两性霉素B、制霉菌素、曲古霉素等。2.吡咯类，包括酮康唑、伊曲康唑、氟康唑、伏立康唑、克霉唑、益康唑等。3.其他类如氟胞嘧啶。抗真菌药物分类--化学结构分类临床标本直接检查检测抗原直接镜检固定标本染色墨汁负染色法KOH法毛发指甲皮屑脑脊液分离培养沙氏培养基25℃37℃观察菌落分子生物学检测动物实验检测抗体病理检查镜检、生化反应小结真菌的致病性真菌的基本特性：菌丝、孢子、培养特性标本采集注意事项常用的检查方法：显微镜检查、分离培养、生化实验思考题：1.简述真菌的致病性特点。2.真菌标本采集是有哪些注意事项？3.形态学检查和培养在真菌检查中的意义。（一）掌握毛癣菌属、表皮癣菌属和小孢子丝菌生物学特性、微生物学检验方法及鉴定。（二）熟悉浅部真菌感染的种类目的要求皮下组织感染真菌毛癣菌属表皮癣菌属小孢子菌属表面感染真菌皮肤癣真菌糠秕马拉色菌着色真菌孢子丝菌•位置：寄居于人体皮肤和毛干的最表层。因不接触组织细胞，很少引起宿主细胞反应。•嗜脂性酵母样菌•代表：秕糠马拉色菌(Malasseziafurfur)•症状：皮肤表面出现花斑癣（汗斑）微生物检验1．直接显微镜检查可采用透明胶带粘贴取材法，将透明胶带直接贴于皮肤表面，数分钟后揭下，直接贴于载玻片上镜检或经棉蓝染色或革兰染色后镜检。可见孢子和菌丝。孢子为圆形或卵形，厚壁，芽颈较宽，常成簇分布；菌丝粗短，呈腊肠样。2．分离培养与鉴定毛癣菌属•毛癣菌属（Trichophyton）属半知菌亚门－丝孢菌目－丛梗孢菌科，有20余种，其中14种能引起人和动物的感染。•临床上常见的有红色毛癣菌(trichophytonrubrum)须癣毛癣菌(T.mentagrophytes,又称石膏样毛癣菌)许兰毛癣菌(T.schoenleinii,又称黄癣菌)紫色毛癣菌（T.violaceum）断发毛癣菌（T.tonsurans）毛癣菌：菌落灰白、红、橙或棕色,表面呈绒毛状、粉粒状或蜡样。大分生孢子细长棒状薄壁。菌丝有螺旋状、球拍状、鹿角状和结节状微生物检验1．标本采集采集新发生的皮肤损害边缘皮屑；指甲近尖端下面甲屑；拔取无光泽病发。2．直接显微镜检查皮屑10%KOH液；指甲25%KOH/25%NaOH处理镜检可见透明、有隔，常有分支的菌丝及成链的关节孢子。皮肤癣菌感染的毛发三.分离培养标本70%乙醇或在青、链霉素混合液内处理5min生理盐水洗3次接种沙氏琼脂斜面25℃培养观察菌落特征。四.其他鉴定试验毛发穿孔试验脲酶试验特殊营养需要试验毛发穿孔试验•将头发发剪成lcm长，置于已加入25ml蒸馏水和2—3滴10％酵母浸膏液的平皿内，高压灭菌。将待检皮肤真菌接种于平皿内，置25℃孵育四周，每周检查一次，每次取数根毛发置载玻片上，经乳酚棉蓝染色后，置低倍镜下观察。若毛发有裂口或陷凹者为阳性，否则为阴性。药物敏感试验对灰黄霉素、伊曲康唑等药物敏感。表皮癣菌属•表皮癣菌属（Epidermophyton）目前只有一个种，即絮状表皮癣菌（E.floccosum）,能引起人类感染。•絮状表皮癣菌是一种常见的皮肤癣菌，可引起皮肤感染如股癣、足癣、体癣、手癣和甲癣。絮状表皮癣菌生物学性状•皮屑和甲屑经+10%KOH液消化镜检可见分枝断裂的有隔菌丝，少见孢子•培养后，菌落初为白色鹅毛状，以后转变为黄色粉末状。镜下可见球拍状菌丝、卵圆形或巨大棒状薄壁大分生孢子，无小分生孢子，在陈旧培养物中可见厚膜孢子。表皮癣菌：菌落初为白色鹅毛状,以后变为黄绿色粉末状。粗棒状薄壁大分生孢子。菌丝球拍状小孢子菌属•我国常见的有铁锈色小孢子菌、石膏样小孢子菌和狗小孢子菌等。•小孢子菌属感染皮肤和毛发，很少感染甲。小孢子菌生物学特性•皮屑和毛发+10%KOH处理镜检，皮屑中有分枝断裂菌丝，在毛发中呈现小孢子镶嵌的鞘包裹着发干。•在沙氏培养基中可见白色、棕黄色或黄褐色、粉末或绒毛状菌落。镜下可见梳状、球拍状或结节状菌丝，卵圆形小分生孢子、厚壁梭形（纺锤形）大分生孢子。小孢子癣菌：菌落为灰色、橘红色或棕黄色，厚壁大分生孢子，菌丝有结节状、梳状和球拍状毛癣菌属表皮癣菌属小孢子癣菌属皮下组织真菌感染•主要有着色真菌和孢子丝菌•着色真菌感染发生在暴露部位，称着色真菌病。卡氏枝孢霉和裴氏着色芽生菌。•申克孢子丝菌，属腐生性真菌，常因外伤接触带菌的花草等引起感染。此菌可引起孢子丝菌下疳。此菌也可引起深部感染。是一种二相性真菌。着色真菌分生孢子：①树枝型、②剑顶型、③花瓶型：多发生四肢暴露部位，开始为小丘疹，表面干燥或湿润，有鳞屑或鳞痂，逐渐形成斑块结节，呈疣状增殖。直接显微镜检查：单个或成群厚壁孢子，有横隔或中间十字分隔。培养：沙氏培养基，生长缓慢，菌落从灰黑色至黑色，有气生菌丝。菌落涂片镜检可见三种类型的分生孢子，有鉴定价值。生化反应：不能水解淀粉，不凝固牛奶，能同化硝酸盐，需维生素B1。对5-FC、伊曲康唑、氟康唑敏感，易产生耐药性孢子丝菌申克孢子丝菌传染源：人和动物传播途径：经破损皮肤接触感染。二相性真菌。微生物检验：(1)直接显微镜检查：卵圆形的孢子。(2)、分离培养与鉴定：将标本接种于沙氏培养基上25℃培养，2-3d开始生长，初为白色湿润的酵母型菌落，以后变为淡咖啡色至深褐色。37℃培养2-3d，可形成乳白色或淡褐色酵母型菌落。（3）、对碘化钾、伊曲康唑、特比萘芬等药物敏感。脚气•脚气是一种常见的真菌感染性皮肤病。•多见于趾间,足底及足缘,有深在性水疱,糜烂及鳞屑,伴有瘙痒等症状.多见于成人,夏秋重,冬春轻,足多汗及常穿胶鞋者易患本病•主要致病菌为红色毛癣菌、石膏样毛癣菌和絮状表皮癣菌。•医学上通常将脚气分三型：糜烂型、水疱型、角化型•本病是由皮肤癣菌所引起的。足部多汗潮湿或鞋袜不通气等都可诱发本病。皮肤癣菌常通过污染的澡堂、游泳池边的地板、浴巾、公用拖鞋、洗脚盆而传染。预防•1．要保持脚的清洁干燥，勤换鞋袜，鞋子要通气良好。•2．不要用别人的拖鞋、浴巾、擦布等，不要在澡堂、游泳池旁的污水中行走。•3．公用澡堂、游泳池要做到污水经常处理，以防相互传染。治疗•灰黄霉素、伊曲康唑•派瑞松:曲安奈德益康唑乳膏达克宁:硝酸咪康唑软膏（一）掌握深部感染真菌概念、分类、检验程序；掌握假丝酵母、隐球菌、卡氏肺孢菌微生物学特性、检验方法及鉴定要点。（二）熟悉荚膜组织胞浆菌孢子鉴别要点。（三）了解抗真菌药物分类及临床应用。目的要求（一）假丝酵母菌属：分类、临床意义、生物学特性、微生物学检验。（二）隐球菌属；分类、临床意义、生物学特性、微生物学检验。（三）曲霉菌属：分类、临床意义、生物学特性、微生物学检验。（四）组织胞浆菌属：分类、临床意义、生物学特性、微生物学检验。（五）卡氏肺孢菌：分类、临床意义、生物学特性、微生物学检验。教学内容DEFINITION•是指能侵袭深部组织和内脏及全身的真菌，主要有假丝酵母菌、隐球菌、曲霉、毛霉、组织胞浆菌和卡氏肺孢菌等。•组织胞浆菌为二相性真菌，假丝酵母菌、曲霉菌、毛霉菌和卡氏肺孢菌等为条件致病性真菌，只有在一定条件下才引起机体致病。第一节假丝酵母菌属•假丝酵母菌（Candida），俗称念珠菌，生物学分类为半知菌亚门、半知菌纲、隐球菌目、假丝酵母菌属。•本属菌有81个种，其中有11种对人有致病性，其中白假丝酵母菌最为常见。(一)白假丝酵母菌条件致病：皮肤粘膜感染鹅口疮，阴道炎内脏感染：肺炎、关节炎、膀胱炎，肾盂肾炎中枢神经感染：脑膜（脑）炎、脑脓肿圆形或卵圆形，直径3-6μm。革兰阳性，着色不均匀。出芽方式繁殖，在组织内可见芽生孢子、假菌丝，在玉米粉培养基中可产生假菌丝和厚膜孢子。MicrobiologyCharacteristics将标本接种在沙氏培养基上，25℃或37℃培养1～４d后，可出现奶油色类酵母型菌落。镜检可见假菌丝和芽生孢子。1)直接显微镜检查：取脓汁、痰和局部炎症性分泌物直接涂片，革兰染色后镜检，显微镜见到革兰阳性(着色不均匀)、圆形或卵圆形菌体或孢子及假菌丝，可确认为假丝酵母菌感染。2)抗原检测：取病人血清作ELISA、免疫印迹法等检测白假丝酵母菌抗原。3)核酸检测：用PCR法将白假丝酵母菌DNA分子扩增后以分子探针检测，具有较好的敏性和特异性。MicrobiologyExamination将标本接种在沙氏培养基上，25℃或37℃培养1～４d后，可出现奶油色类酵母型菌落。镜检可见假菌丝和芽生孢子。鉴定1)芽管形成试验：将假丝酵母菌接种于0.2～0.5m|血清中，37℃孵育1.5～４h观察有无芽管形成。白假丝酵母菌可形成芽管，其他假丝酵母菌不形成芽管。将假丝酵母菌接种于玉米粉培养基25℃孵育1-2d后，白假丝酵母菌在菌丝顶端、侧缘或中间形成厚膜孢子。2)厚膜孢子形成试验：3)糖同化或发酵试验C.albicans(green)白念C.tropicalis(blue)热带C.parapsilosis(white)近平滑C.glabrata(pink).光滑/克柔商品化的产色培养基可快速鉴定白假丝酵母菌和其他假丝酵母菌。(4)药物敏感试验：对二性霉素B、5-FC等药物敏感，但对5-FC极易产生耐药性。(5)抗体检测：可用ELlSA夹心法、免疫酶斑点试验，方法简便。也可用乳胶凝集试验和对流免疫电泳试