微生物遗传育种论文

1离子注入微生物诱变育种的研究与应用进展郝瑶11生工1班20110801111摘要：离子束作为一种新的诱变源虽然在微生物上的应用起步较晚，但成果显著。这项技术适用于多种微生物，也可以和其它方法结合对菌种进行复合诱变。这一技术在对微生物诱变育种的研究中，表现出比传统诱变方法高的诱变效率，利用离子注入进行微生物菌种改良已在生产实践中得到广泛的应用，并取得了显著的经济效益和社会效益。该研究对离子注入微生物诱变育种的理论研究进展和实际应用情况进行了综述。关键词：离子注入；微生物育种；诱变；综述1引言离子束作为一种生物品种改良的新技术是由中国科学院等离子体物理研究所[1-2]于1986年开创的,经过近30年的发展,这方面的研究无论在理论上还是实际应用上都取得了一定的进展,已在诱变育种、植物转基因、生命起源和进化以及环境辐射与人类健康等方面取得了一些重要的阶段性研究结果,其中在微生物诱变育种的研究中,利用离子注入进行微生物菌种改良已在生产实践中得到广泛的应用，并取得了较好的研究成果和良好的生产效益[3]。经过近20多年的发展,无论从理论上还是实际应用中,离子束生物技术已在诱变育种、创造生物体新种质的实用技术研究中取得了一定的进展,为生物的遗传改良开辟了新途径。2离子束生物技术的机理和优点2.1离子束生物技术的作用机理借助于低能离子注入技术使生物体的特征特性发生本质变化,进而对生物体进行遗传改良是离子束生物技术的主导思想,离子生物技术是将能量为几万至几十万伏的离子束射入生物体内,在离子束的能量、质量和电荷三因素作用下,使基因产生突变,再从这些变异的种子中选出优良变异种质,经过培育而成为新品种。因此,能量、质量、电荷成为离子束生物技术作用的核心,能量沉积效应[4]、质量沉积效应[5]、电荷交换效应[6]是目前离子束生物技术的主要理论依据。其中,能量沉积指注入的离子与生物体大分子发生一系列碰撞并逐步失去能量,而生物大分子逐步获得能量进而发生键断裂、原子被击出位、生物大分子留下断键或缺陷的过程;质量沉积指注入的离子与生物大分子形成新的分子;动量传递会在分子中产生级联损伤;电荷交换会引起生物分子电子转移造成损伤,从而使生物体产生死亡、自由基间接损伤、染色体重复、易位、倒位或使DNA分子断裂、碱基缺失等多种生物学效应。2.2离子束生物技术的优点离子束诱变的主要优点表现在:一是变异频率高,可选择注入的离子种类多样,而且其质量、能量、电荷可有多种组合,所以其产生的诱变结果和效应也是多种多样的。二是变异谱宽,离子束的LET(传能线密度)大于C射线和中子,能产生较高的电离密度,使DNA产生严重2损伤,其作用于植物体后可获得较高的突变频率和较广的突变谱,易于筛选出新的突变体[7]。三是变异稳定快,离子注入造成的损伤不易修复,突变体稳定较快[8]。四是技术稳定可靠,简单易得,在电场、磁场的作用下被加速或减速以获得不同的能量,而且可对其进行高精度的控制,从而可获得平行束,也可被聚焦成微细束,在固体内的直进性好[9-10];经加速后的离子具有一定的静止质量,注入生物体后可以使质量、能量和电荷共同作用于生物体[11]。因此离子束生物技术将成为生物培养与改良中的一种非常重要的手段之一。3离子注入微生物的方法及影响因素3.1离子注入微生物的方法微生物诱变育种，一般采用生理状态一致、处于对数生长期菌体的单细胞进行理化处理，这样才能使菌体均匀接触诱变剂，减少分离现象的发生，获得较理想的效果。对于以菌丝生长的菌体，则利用孢子来诱变。同样，离子注入微生物育种也符合该规律。离子注入机装置固定、操作程序规范，因此菌体的前处理,获得高活性的单细胞是离子注入微生物育种的关键点。许多研究证明，利用菌膜法或干孢法进行离子注入效果较好。首先，取培养活化的菌体种子液或斜面活化的菌苔进行稀释，一般是10-2~10-3的稀释度，菌体浓度为108~109个/ml为宜；然后，吸取适量的菌体稀释液涂布于无菌的玻璃片或无菌培养皿上，显微镜检验保证无重叠细胞，自然干燥(约10min)或用无菌风吹干形成菌膜，放入离子注入机的靶室(具有一定的真空度)进行脉冲注入离子。要有无离子注入的真空对照和空气对照[12]。离子注入过程中，菌体活性的研究鲜有报道。甄卫军等[13]初步研究了无菌水、无菌生理盐水、无菌脱脂奶保护剂对菌膜菌株活性的影响，发现保护剂保护作用强，但是影响离子注入，起到能量反射和屏蔽作用；无菌生理盐水对菌株的活性保留最大。3.2离子注入过程中的影响因素用离子注入法进行微生物诱变育种，一般采用生理状一致、处于对数生长期的菌体单细胞为试验对象，使菌体均匀接受注入离子，减少分离现象的发生，方可获得较理想的效果。研究显示利用菌膜法进行离子注入的效果较好［14］。低能离子束不能在常压下形成，所以离子束对样品的处理只能在真空中进行，而代谢活动旺盛的微生物，含水率高，需要对其进行一定的干燥处理，因此在离子注入过程中特别关注真空条件对菌体活性和注入效果的影响。真空导致的存活率下降主要集中在样品放入真空靶室的瞬间，突然暴露于高真空，细胞内水分在短时间内快速蒸发带走大量热量，细胞温度急剧下降，胞内自由水迅速形成冰晶；另外，当细胞从真空取出后冰晶受热融化使水分重结晶，再度对细胞造成伤害，导致了细胞的大量死亡。真空致死率也与菌体的敏感性有关。对于细胞壁较厚的微生物，真空致死作用不太明显；但对于细胞壁较薄，耐受力差的微生物，靶室内真空的致死作用非常显著［15］。因此，为了排除真空致死对离子研究注入效应的影响，离子注入的致死率通常以真空致死率作为对照。试验中可以用脱脂牛奶、生理盐水、甘油等对菌体进行保护，但是保护剂会起到能量反射和屏蔽作用，影响离子注入的效果[16]，另外，非注入因素如干燥时间也会对离子注入的生3物效应造成影响，杨天佑等研究发现在E.coli干燥18-21min内，菌体的存活率急剧下降。4离子注入微生物诱变育种的应用现状和前景4.1离子注入微生物诱变育种的应用现状4.1.1离子束介导转基因技术在微生物中的应用离子束介导转基因是利用低能离子束对细胞的刻蚀作用原理设计出的一种新的转基因方法，注入离子对细胞的刻蚀可使细胞由表及里形成微孔或洞，供体DNA片段可顺利地通过这些微孔或洞进入受体细胞,宋道军等[17]介导转基因提高E.coliUV敏感菌株的DNA损伤修复能力的实验证明离子束介导转基因不仅适合于植物细胞,而且对微生物细胞也是可行的，其绝对转化率为2.4%，比CaCl2溶液诱导受体细胞处于感受态进行转基因法高。4.1.2微束技术的发展与应用微束是一种能把辐射聚焦或准直到微米水平的装置。近年发展起来的现代微束技术可准确地将单一或精确数量的粒子射入细胞或细胞的不同部位,如细胞核、细胞质或被检测细胞的相邻细胞。低能微束技术的出现使了解胞内、胞间通讯,细胞的损伤修复,进行基因定位注入和细胞手术成为可能。相信随着微束技术的进一步发展,不仅在基础理论层面上,可以使离子注入生物学效应的本质得到解释,而且在应用层面上实现微生物和其他动、植物的定向育种。4.1.3离子注入和其他方法结合安徽农业大学轻工学院的李平[18]等对黑曲霉原生质体进行紫外、LiCl复合诱变,其B-葡萄糖苷酶的酶活由出发菌株的10u/mL提高到14.7u/mL。再对高产突变株进行氮离子注入，酶活又提高20%。陈宇等利用离子注入对红霉素产生菌进行诱变育种的工作中发现离子注入诱变效果明显，其突变范围和突变程度要高于紫外线诱变。因为离子注入在微生物体内所发生的作用很复杂，包括物理、化学及生物学的反应，迄今对诱发突变还不能进行理性控制，只能是随机的，尤其对新菌种及其代谢产物的生物合成途径和调节机制还不清楚的情况下，利用多种诱变方法对菌种进行复合诱变也可以提高筛选效率，进一步研究诱变机理。综上所述，离子束作为一种新的诱变源，在对微生物诱变育种的研究中表现出比传统诱变方法高的突变率和诱变效率，利用离子注入进行微生物菌种改良已在生产实践中得到广泛的应用，并取得了显著的经济效益和社会效益。以微生物为试材进一步对离子注入的诱变机理进行研究，不仅可以指导微生物菌种改良，也可以深入的了解注入离子与生物体的作用机制,为离子注入的广泛应用提供理论依据。4.2离子注入微生物诱变育种的前景目前我国发酵行业在生产中存在着两大问题。首先，与国外相比，我国生产使用菌种的发酵水平低。如国外高浓度发酵的酒精浓度达到14%~15%，而我国目前的生产水平仅能达到10%左右；糖化酶国外发酵水平为50000国际单位/mL,国内为35000国际单位/mL左右；柠檬酸发酵水平国外为18%，国内为12%~14%；乳酸国外发酵水平为18%，国内为10%左右；4赖氨酸国外发酵水平为16%，国内为9%左右。其次，与国外相比，我国生产使用设备及产品的后续提取工艺落后,产品的收率低。如谷氨酸钠(味精)，国外的提取收率为95%以上，国内最高仅达到92%。专家指出,这两低是困扰我国发酵行业的两大顽症，也是影响企业效益的最根本因素。可以看出，由于国内企业受资金匮乏、设备落后、技术创新能力相对薄弱等因素的限制，加之对科研没有足够的重视，这些都造成我国发酵行业整体水平与国外发达国家相比有较大的差距。目前，涉及发酵产品的国内医药、食品、化工、饮料等行业的许多生产原材料不得不从国外进口。加入WTO后,我国许多跟踪国外的发酵产品将面临更大的冲击。显然，要解决上述两大问题，一要从科研着手，选育出发酵水平高或者产抗生素效价高的新菌株；二要加强技术改造与革新能力，引进国际上的新工艺、新设备及后续提取的先进技术。第二个问题对企业而言相对容易解决，而且解决的渠道也比较多,但要得到高水平的发酵菌种并非易事。专家认为,必须依靠坚实的科研基础和持续不断的科技创新才能实现。简言之，必须突破目前常规育种模式，有新的方法产生，才能从根本上选育出高水平的新菌种。离子束生物技术就是在这种背景下应运而生的菌种选育新方法，并已被生产实践证明是一种行之有效的微生物菌种选育的方法，也是一种不可替代的育种方法。这一创新技术如能尽快在国内的微生物育种科研单位及企业得到推广，将加快我国的微生物育种水平早日赶超世界先进水平的步伐。现在该技术已经在全国二十多个省、市的近百个研究单位及企业得到应用，取得了显著的效果。技术发明单位中科院等离子体所利用离子束生物工程技术育成的新菌种已转让给许多家企业,如江苏江山制药、江西赣南制药、宁夏食品色素厂、东北制药总厂、淮南抗生素厂、武汉抗生素厂、武汉烯王生物工程公司等，使这些企业得到了快速发展或走出困境。相信随着这项技术的进一步发展，会给我国的发酵行业带来更大的经济和社会效益。5问题与展望离子注入技术已在工业微生物菌种选育上获得了巨大的成功。而且还不断扩大其在工业微生物的应用领域。但也要看到，离子注入技术的发展也面临一些必须解决的问题，主要有：一、离子注入需在真空条件下进行，这使得以活菌体或原生质体为材料的诱变受到制约；二、在加速器对菌体的“加工”定位还不够精确，三、注入离子的种类还是较少，急需扩大范围；四、有关离子注入机理的研究还需进一步加强。因此，未来离子注入微生物诱变育种的研究将围绕这几个大方向而深入发展。5参考文献[1]余增亮.离子束生物技术引论[M].合肥:安徽科学技术出版社,1996:137.[2]余增亮.离子束与生命科学:一个新的研究领域[J].物理,1996,26(6):333.[3]GuSB,LiSC,FengHY,etal.Anovelapproachtomicrobialbreeding-low-energyionimplantation[J].ApplMicrobiolBiotechnol,2008,78:201.[4]宋道军,余汛,姚建铭,等.低能离子束对微生物细胞的刻蚀与损伤研究[J].生物化学与生物物理学报,1998,30(6):570-574.[5]ShaoChunlinXu,YuZengliang.Chargeexchangeeffectofionimplantationtobiomolecules[