性激素通过IL-1_IL-1R通路促进原发性肝癌的机制的研究性激素通过IL-1_IL-1R通路促进原

修改意见：性激素通过IL-1/IL-1R通路促进原发性肝癌的机制的研究[摘要]目的探讨雌激素E2(Estradiol，E2)是否对原发性肝癌的发生发展有促进作用，以及该作用机制是否通过白细胞介素-1(Interleukin-1，IL-1)/白细胞介素-1受体（Interleukin-1receptor，IL-1R）通路。方法选取我院2013年1月至2014年6月接收的原发性肝癌男性患者作为观察组，选取同期接收的非原发性肝癌患者作为正常对照组，分别采用ELISA法检测两组患者血清中的E2、IL-1β和VEGF浓度，采用Westernblot法检测两组肝肿瘤组织和正常肝组织中E2R和IL-1βR蛋白表达水平。结果观察组患者血清中E2、IL-1β和血管内皮生长因子(VascularEndothelialGrowthFactor，VEGF)浓度显著性高于正常对照组，且两组间比较具有显著性差异（P0.01）；观察组肿瘤组织中E2R和IL-1βR蛋白表达水平显著性高于正常对照组，且两组间比较具有显著性差。异（P0.01）。结论E2对原发性肝癌的发生发展具有促进作用，且改作用机制可能是通过上调IL-1/IL-1βR通路，促进VEGF的表达，引起肿瘤血管的形成而完成的。[关键词]雌激素；白细胞介素-1；白细胞介素-1受体；原发性肝癌[中图分类号]TQ460.7[文献标识码]AMechanismofprimarylivercancerpromotinghormonepathwaythroughIL-1/IL-1R[Abstract]ObjectiveToinvestigatewhetherestrogenE2(Estradiol,E2)forthedevelopmentofprimarylivercancerarepromoted,aswellasthemechanismofactionisthroughinterleukin-1(Interleukin-1,IL-1)/IL1receptor(Interleukin-1receptor,IL-1R)pathway.MethodsSelectedmalepatientswithprimarylivercancerastheobservationgroupofourhospitalfromJanuary2013toJune2014.Selectedthesameperiodofnon-primarylivercancerpatientsasnormalcontrolgroup,thepatientsweredetectedbyELISAserumE2,IL-1βandVEGFconcentrationsweredetectedbyWesternblotinlivertumortissueandnormallivertissueandIL-1βRE2Rproteinlevels.ResultsSerumobservationgroupE2,IL-1β,andvascularendothelialgrowthfactor(VascularEndothelialGrowthFactor,VEGF)weresignificantlyhigherthanthenormalcontrolgroup,andbetweenthetwogroupswassignificantdifference(P0.01);ObserverGroupE2RtumortissueandIL-1βRproteinlevelsweresignificantlyhigherthanthenormalcontrolgroup,andbetweenthetwogroupswassignificantdifference(P0.01).ConclusionThedevelopmentofE2topromotetheroleofprimarylivercancer,andthemechanismofactionmaybechangedbyupregulatingIL-1/IL-1βRpathwaypromotestheexpressionofVEGF,causingtheformationoftumorbloodvesselsandcompleted.[Keywords]estrogen;interleukin-1;interleukin-1receptor;primarylivercancer原发性肝癌是临床中较为常见的恶性肿瘤，在世界各国的发病率都非常高[1]。在我国原发性肝癌是临床发病率最高的恶性肿瘤之一，原发性肝癌在男女人群中有着非常特殊的规律，男性人群的发病率远远大于女性人群的发病率，男女比例达到7:1[2]。已有研究表明肝癌的发生与体内的激素水平的高低异常有着密切的关系，肝癌的发生、发展以及肝癌的生物学特性的变化与肝癌组织中性激素受体表达的低下有关，导致了男性人群中患有原发性肝癌的机率远远大于女性人群[3,4]。癌细胞的转移在癌症的发生发展过程中起着极其重要的作用，而癌细胞的转移又是一个极其发展的过程，包括多个环节，如恶性肿瘤早期的生长、血管在肿瘤中的新生、肿瘤细胞的脱落、脱落后的肿瘤细胞入侵到新的基质中、在新的组织器官中生长等等[5,6]。在这些极其发杂的环节中癌细胞的转移是在多种细胞因子的调控下完成的，如白细胞介素-1（IL-1），今近来研究表明IL-1与肝肿瘤的转移有着密切的关系，IL-1的异常升高可以促进原发性肝癌症的发生发展[7]。目前上没有文献报道雌激素是否通过IL-1/IL-1R通路拮抗原发性肝癌的研究。本研究观察原发性肝癌患者组织或血清中雌激素及其受体、IL-1β及IL-1βR，以及相关指标，来探究性激素是否通过IL-1/IL-1R通路拮抗原发性肝癌和该通路的相关分子机制。1材料与方法1.1一般材料选取2013年1月至2014年6月南方医科大学南方医院接受手术切除的原发性肝癌患者33例作为观察组（所用患者均经病理证实），为避免女性患者经期体内性激素的变化对研究的影响，所有的研究对象均为男性，年龄为34岁至78岁，平均年龄为51.2±4.6岁，所用患者在研究前均未接受任何的放疗和化疗；另外取同期我院接受的18例非原发性肝癌患者（11例为肝外伤患者，7例为肝脏内胆管结石患者）作为正常对照组，其中男性18例，年龄33岁至75岁，平均年龄为50.3±3.7岁。患者均签署了知情同意书。本实验经过南方医科大学南方医院伦理委员会审核通过。所有研究对象均清晨空腹采集静脉血保存于-20℃冰箱中，观察组合正常对照组所采集的肿瘤和正常肝组织保存于-80℃冰箱中。对所用研究对象排出标准为：有严重的心脑血管疾病患者，有酒精性肝病和脂肪肝患者，患有原发性胆汁肝硬化和肝硬化性胆管炎患者，接受抗病毒治疗的患者。1.2主要试剂与仪器雌二醇、VEGF、IL-1β酶联吸附检测试剂盒（购自上海绿叶生物技术有限公司，批号分别为140311、140402、140423），雌激素受体（E2R）一抗，白介素-1β（IL-1βR）一抗为兔抗人（购自武汉博士德生物工程有限公司，批号分别为：03120514、0312010415），雌激素受体（E2R）二抗，白介素-1β（IL-1βR）二抗为羊抗兔（购自Chemicon公司，批号分别为5520836784、0603067823），Centrifuge5417R型离心机（Eppendorf），酶标仪（BioTekSYNERGYTM4），垂直电泳仪（Bio-Rad）。1.3方法1.3.1血清中E2、VEGF和IL-1β浓度检测分别将观察组合正常对照组患者清晨空腹采集的静脉血用离心机离心分离血清，离心条件为3500r/min转速，10min离心时间，分离得到的血清按照酶联吸附检测试剂盒说明书操作检测观察组合正常对照组患者血清中的雌二醇、VEGF、IL-1β的浓度。1.3.2组织中E2R和IL-1βR蛋白表达水平的检测分别将从观察组合正常对照组患者采集的肿瘤和正常肝组织用匀浆器加RIPA匀浆裂解，分离得到的组织提取上清液和loadingbuffer(5×)按照4:1的比例混和煮沸，用垂直电泳仪电泳分离组织提取上清液中的目的蛋白，待目的蛋白充分分离后再将目的蛋白转移到硝酸纤维素膜中；转移后在5%脱脂奶粉中封闭两小时；PBST反复洗膜3次，10min/次；加入E2R和IL-1βR一抗，稀释1000倍，在4℃冰箱中过夜孵育；PBST反复洗膜3次，10min/次；在二抗稀释2000倍在常温孵育1小时；在目的蛋白相应的位置涂布ECL，在暗室中曝光成像到胶片中；扫描分析个目的蛋白的条带灰度值。1.4统计学方法所得到的研究数据均以xs表示，应用SPSS17.0统计软件对所得到的研究数据进行统计分析，组间比较采用t检验，用P0.01作为判定差异具有统计学意义的依据。2结果2.1血清中E2、VEGF和IL-1β浓度的浓度观察组中原发性肝癌患者血清中的E2、VEGF和IL-1β浓度均分别显著高于正常对照组患者血清中的E2、VEGF与IL-1β的浓度，且两组间的差异具有统计学意义，即P0.01。结果表明原发性肝癌患者体内E2、VEGF、IL-1β合成分泌量均有升高。具体结果见表1。表1两组血清中E2、VEGF、IL-1β浓度检测结果（xs,pg/ml）Tab.1TwogroupsofserumE2,concentrationofVEGF,IL-1betatestresults(xs，pg/ml)组别例数E2VEGFIL-1β正常对照组1825.176.98178.1350.4115.113.09观察组3343.189.01#432.7474.19#30.215.76##P0.01，与正常对照组比较，comparedwithcontrolgroup2.2组织中E2R蛋白表达水平观察组中原发性肝癌患者肿瘤组织中的E2R蛋白表达量显著高于正常对照组患者正常肝组织中E2R蛋白表达水平，且两组间的差异具有统计学意义，即P0.01。结果表明原发性肝癌患者肝肿瘤组织中的雌二醇受体表达量增加。具体结果见图1。图1.两组组织中E2R蛋白表达水平1.正常对照组；2.观察组#P0.01，与正常对照组比较Fig.1proteinlevelsofE2Rintwoingroups1.Controlgroup;2.Observergroup#P0.01,comparedwithcontrolgroup2.3组织中IL-1βR白表达水平观察组中原发性肝癌患者肿瘤组织中IL-1βR蛋白表达量显著高于正常对照组患者正常肝组织中IL-1βR蛋白表达水平，且两组间的差异具有统计学意义，即P0.01。结果表明原发性肝癌患者肝肿瘤组织中的白细胞介素-1β受体表达量增加。具体结果见图2。图2.两组组织中E2R蛋白表达水平1.正常对照组；2.观察组#P0.01，与正常对照组比较Fig.2proteinlevelsofE2Rintwoingroups1.Controlgroup;2.Observergroup#P0.01,comparedwithcontrolgroup3讨论肝癌的发病率极高，在恶性肿瘤中排第5位。原发性肝癌的发生发展如同其他癌症是一个极为发杂的多环节过程，其发病原因多样，如病毒感染、黄曲霉毒素导致肝脏损伤、酒精导致肝脏损伤、肝硬化、体内激素异常[8]。近年来临床观察统计结果发现原发性肝癌的男性患者的发病率远远高于女性患者的发病率，这一结果逐渐引起人们注意，性激素异常与肝癌的发生发展逐渐成为研究的热点，研究表明体内性激素水平的失常可以引起体内细胞生物学的异常，进而会导致肿瘤的发生。性激素与存在体内的多种亚细胞器上的相应的受体结合，进而可以调节细胞多种生理生化过程，包括免疫反应、多种细胞的凋亡和增值[9]。有研究表明雌激素受体（ER）mRNA在肝癌组织中的表达阳性率远远大于在正常肝脏组织中的阳性表达率。ERα与ERβ是雌激素