性病实验室检测的技术标准和操作规程[1]

江干区人民医院性病实验室检测操作规程参照标准1、医疗机构性病门诊规范化管理资料汇编，2、试剂相关说明书2010.12.1目录一、淋病检查的实验室技术.........................................................................................................................2(一)分泌物涂片检查..............................................................................................................................2（二）淋球菌的分离培养.....................................................................................................................3（三）淋球菌的保存.............................................................................................................................4（四）氧化酶试验.................................................................................................................................4二、支原体的检测.........................................................................................................................................5三、衣原体检查.............................................................................................................................................6四、梅毒的实验室检测.................................................................................................................................7(一)直接镜检..........................................................................................................................................7（二）非特异性梅毒螺旋体试验.........................................................................................................8五、TPHA梅毒螺旋体血凝试验..................................................................................................................8一、淋病检查的实验室技术(一)分泌物涂片检查急性淋菌性尿道炎患者常有大量脓性分泌物。在有些脓细胞内可见革兰氏染色呈阴性的双球菌，椭圆或球形，常成双排列。因形态特殊，可取患者尿道分泌物制成涂片后染色，检查有无典型细胞内革兰阴性双球菌，可作为初步诊断的依据。标本采集尿道分泌物、宫颈粘液、尿的离心沉淀物。涂片镜检涂片后，待自然干燥后，加热固定，行革兰氏染色，油镜观察。结果在急性患者的尿道脓性分泌物革兰染色涂片中，常可见到大量红色多形核白细胞，有些细胞中吞噬有淋球菌。多数多形核白细胞中并不含淋菌，但不少细胞中常含有1对或数对，甚至20~30对。淋球菌常存在于细胞浆内。在病期较长或经过治疗的淋病患者的涂片中淋球菌比较少，有时呈单个、四联和八叠状，且常位于细胞外。对有些细菌难以下结论时，需进行培养和鉴定。注意事项1．涂片时不要用力涂擦，而应将棉拭在玻片上轻轻滚动。涂擦过重，细胞容易破裂变形，致细菌从胞内溢出。2．涂片厚薄适宜。过厚，加之染色过程中脱色时间不足，革兰染色易呈紫色。因此，脱色时间要视涂片厚薄而定。3．固定涂片时，迅速通过火焰2~3次，避免加热过度使细胞变形。热度以不烫手为宜。4．不推荐用涂片检查来诊断淋菌的直肠和咽部的感染，也不推荐用来作判愈。方法评价涂片检查方法简便、有效、价格低廉且有一定的敏感性和特异性。但其特异性随取材部位的不同而有所不同。男性尿道取材特异性较高，而从女性子宫颈取材特异性较低。因此，世界卫生组织不推荐用涂片法来诊断女性患者。革兰氏染色（一）操作步骤1.细菌涂片须经火焰固定。2.先用甲液滴加在标本上，加的量以盖住标本为准，再加等量的乙液，混匀，染3-5秒，用自来水从玻片的一端冲去染液，甩干。3.滴加适量碱性碘液在标本上，3-5秒后，自来水冲洗，甩干。4.丙酮酒精脱色，脱色的标本为：当丙酮酒精滴加在标本上，不出现蓝色或淡紫色为宜。5.用碱性复红复染，覆盖标本，3-5秒后，自来水冲洗，待其自然干燥或用吸水纸吸干，油镜观察。（二）淋球菌的分离培养如果标本中有淋球菌，则在合适的培养基上经培养后可长成菌落。各种细菌在培养基上生长的菌落形态各不相同。根据菌落的大小，表面高起或扁平、光泽、色素和边缘的情况等，作为细菌鉴定的标准。1．方法（1）取材培养要取得成功，取材部位和方法要准确。由男性患者前尿道取材时，应该用细小拭子伸入尿道口2~4cm，取出的分泌物应略带粘膜。从女性患者宫颈取材时，应先用温水湿润扩阴器（不能用液体石蜡等润滑油）。应让棉拭充分吸附分泌物。从直肠取材时，应将棉拭插入肛门2.5cm以上，如果棉拭碰到粪便，应换一个棉拭重取。检查淋菌性咽炎时，应从扁桃体及扁桃体窝取材。为了提高阳性率，可同时取二份标本进行培养。（2）培养基由于淋球菌的营养要求复杂，所用的培养基中应含有动物蛋白及细菌和生长所需的多种因子。目前国内常用的是血液琼脂或巧克力琼脂。为抑制杂菌，在培养基中可加入少量抗菌素和淋球菌增菌剂，使大多数杂菌被抑制而淋球菌菌落长得较大，在平皿中几乎呈纯培养，从而提高分离的阳性率。（3）培养条件淋球菌对外环境变化颇为敏感，对寒冷和干燥抵抗力很弱。因此，取材后应立即接种。接种的平皿应先放在37℃温箱中预温。培养的最适温度为35℃~36℃，超过38.5℃或低于30℃便生长不良。最初从人体分离时，需用5%二氧化碳环境，为保持一定的湿度，可在培养缸中放些湿棉球。2．结果淋球菌平皿上经24~48小时的培养后，可形成椭圆形、凸起、浸润、光滑、半透明或灰白色菌落。边缘呈花瓣状，用接种环触之有粘性。如继续培养，菌落面积增大，表面变得粗糙，边缘出现皱缩。从菌落上取材涂片，形态有25%较为典型，其他75%为单球菌、四联形或八叠形。3．注意事项（1）取材是培养获得成功的关键。因为淋球菌好发于柱状上皮细胞，取材深度一定要够，女性患者取材时，将棉拭插入宫颈管，转动并停留10~30秒，蘸取少量粘膜，阳性率才高。（2）对症状不典型的男性患者，最好是在晨起排尿前或排尿后2~3小时后取材。必要时做前列腺按摩取材。（3）对女性淋病的检查主张用淋球菌培养。（4）观看菌落特征最好在36小时左右。培养24小时，菌落小，难以辨认其特征。超过36小时，菌落特征也会有较大改变。4．方法评价培养法对男性及女性标本都是适用的，是世界卫生组织推荐筛查淋病患者的唯一方法，也是诊断淋病的金标准。（三）淋球菌的保存淋球菌在巧克力琼脂或血琼脂上需每天传代，将血液琼脂上的培养物洗于无菌的脱脂牛奶中，存放于-25℃冰箱可保存2个月，于-70，可保存1年，如保存于液氮中，可无限期保存。也可将细菌洗于30%甘油肉汤培养基（甘油30mL，营养肉汤70ml，121℃灭菌15分钟）0.5ml中，低温冷冻；或将菌种于巧克力琼脂斜面，36℃培养过夜后以灭石蜡覆盖，盖好盖后放37℃保存。使用时只需从斜面上刮下少许淋球菌进行传代培养，不必将石蜡倒掉。淋球菌在37℃可存活6个月以上。（四）氧化酶试验淋球菌具有氧化酶，能使氧化酶试剂氧化，出现颜色反应。1、称取氧化酶试剂（盐酸二甲基对苯二胺或盐酸四甲基对苯二胺）0.1g，溶于10ml蒸馏水中。装于棕色小瓶，冰箱保存备用。2、在混有杂菌的淋球菌分离平皿上，如发现有符合淋球菌特征的菌落，可在其上滴加氧化酶试剂一滴，如菌落在接触氧化酶试剂10~15秒钟内出现红色并保持30秒钟以上（最后变成黑色）者为氧化酶试验阳性。3、也可先将试剂滴在一张滤纸上，然后挑取可疑菌落与之接触，或先将菌落涂在滤纸上再滴加试剂，观察有无红色出现。菌落显红色为阳性。4、氧化酶试验对快速鉴定淋球菌有一定意义。淋球菌氧化酶试验阳性，但氧化酶阳性的不全是淋球菌。为了保证有良好的反应，不要使用过分陈旧的氧化酶试剂，正常的氧化酶试剂应为粉红色，如试剂已成灰黑色，说明已失效而不应再使用。试剂配好后应避光保存并尽快用完，因此，每次不要多配。氧化酶试刘遇铁也会出现红色而造成假阳性，因此，操作用的接种环最好用铂丝做成，在用其它材料时应检查未挑菌落的接种环在接触沾有试剂的滤纸时是否有红色出现。二、支原体的检测支原体是介于病毒和细菌之间的一类无细胞壁,能用非活体细胞进行培养的最小微生物。人类支原体均属支原体科范畴，共有14种。其中有常引起呼吸道感染的肺炎支原体，常引起泌尿生殖道感染的解脲支原体(UU)和人型支原体(Mh)。[实验室检查]一、标本采集棉拭或疑有感染的分泌液等。由于支原体对热及干燥很敏感，故宜及早接种。二、分离培养及鉴定解脲支原体含有脲酶，以尿素为能量来源，分解尿素产生NH4+使培养基变碱，人型支原体能利用精氨酸释放氨，在含有酚红指示剂的液体培养基中使培养基颜色由黄变红。三、设备及材料1、液体培养基内含牛心浸液，小牛血清，新鲜酵母浸膏，0.05%尿素，0.002%酚红和抗生素2、普通恒温培养箱四、操作用无菌微量移液嘴吸取50ulEPS于培养基中或是把棉拭放入培养基中混匀挤干后取出，37℃，24-48小时观察结果。五、结果判断阳性：透明玫瑰红（或稍有混浊）阴性：黄色或桔黄色；混浊粉红色可能由细菌污染也多为阴性。六、方法学比较支原体直接镜检的意义不大，其形态难与组织细胞或渗出液中的其它颗粒相区别，故不利于临床诊断。用特异性抗体鉴定支原体及血清学分型的方法有生长抑制试验、补体结合试验、荧光免疫反应，但是目前还没有理想的诊断支原体感染的血清学方法，确证必须进行分离培养和鉴定。在固体培养基上UU生长成微小油煎蛋状菌落，需用Dienes染色后用光学显微镜观察才能看清楚。三、衣原体检查衣原体：是介于细菌与病毒之间的，专性真核细胞内寄生的原核细胞型微生物。其主要特征是具有独特的发育周期，在宿主细胞内能形成光学显微镜可见的细胞内包涵体。衣原体一共有15种血清型，其中可引起男女泌尿生殖系疾病的是D~K型。实验室检查标本采集：标本选送的正确与否，直接影响到阳性分离率。因衣原体感染女性子宫颈柱状上皮细胞和男性尿道上皮细胞，为确保采集到足够的标本量，应将棉拭沿表面反复滚动10-30秒，女性避免与阴道接触，男性在标本采集之前一小时内不应小便。采集时必须从上皮部位用力拭刮，脓性分泌物不适用于衣原体检查，应先清除后再采样。抗原检测：斑点免疫层析法原理：标本窗的吸收垫含有免疫金复合物（含有抗衣原体属特异性脂多糖表位和乳胶标记的单克隆抗体-小