感受态细胞的制备和质粒的转化实验

生物工程大实验学院：生命科学学院专业：10级生物工程班级：三班姓名：林冬学号：1009030302指导教师：肖露老师感受态细胞的制备和质粒的转化实验一．实验目的：1.掌握用CaCl2法制备感受态细胞的原理和方法。2.学习和掌握质粒DNA的转化和重组质粒的筛选方法。二．实验原理：细菌吸收外源DNA的能力最高时的状态被称为感受态细胞。有些种类的细菌在其生长的任一阶段都处于感受态，而另一些细菌只有处于某个生长时期时（一般为对数生长早、中期），才会处于感受态，如本实验所用的大肠杆菌。用一定浓度的CaCl2处理对数生长早中期的细菌可以大大提高细菌吸收周围环境中的DNA分子的能力。对这种现象的一种解释是CaCl2能使细菌细胞壁的通透性增强，从而提高转化率。这种转化方法称为“化学法”。三．材料：设备与试剂四．实验方法：①取100mlDH5ɑ培养物置于冰浴中10min，同时将0.1mCacl2和灭菌的50ml离心管4℃中放置10min.②在无菌条件下将培养物移入50ml离心管中（不能超过2/3体积约30ml）平衡后对称放入离心机，在4℃，6000转/min,离心5min,停止离心后，弃上清液（在超净工作上无菌条件下操作）③加入5ml预冷的0.1molCacl2溶液，用涡旋振荡器振荡均匀使DH5ɑ细胞重新悬浮，置于冰水浴中旋转20min后，在4℃6000转/min离心5min,弃上清。④细胞重复③一次，离心后弃上清，沉淀后用4mlCacl2悬浮，加灭菌甘油至浓度15％左右，混匀后分装于1.5mlEP管中，200ul/管，于80℃冰箱中冻存备用。转化实验：200ul感受态→加入1ul质粒混匀→42℃水浴90s→迅速拿出置于冰浴2min→加入800ulLB培养基→37℃，220rpm振荡培养1h→取出100ul涂板。单菌落扩大培养用接种环挑单菌落接入含150ml液体LB培养基锥形瓶中。37℃，120rpm摇瓶培养，直至透过菌悬液看报纸上的字能够看出形状但不能辨认。碱裂解质粒及载体的提取1.先取1.5ml菌液于EP管，然后再1200转离心，弃上清，取1.5菌于EP管中（重复2次）共取4.5ml菌液沉淀，收集于EP管中，→150ul(溶液I[SET]悬→1200r/min离心1min→弃上清，浮沉淀重用。150ulSET悬浮（可用涡旋振荡器冰水浴上放5min→加350ul溶液II，巅倒EP管30次（动作要轻）→冰水浴放5min→加溶液III300ul,轻混匀（同上）→冰水浴放5min→12000r/min离心8min→上清移入新的EP管中→加入0.6v的异丙醇（500ul）→室温静置15min→12000r/min离心8min→弃上清液，沉淀用75％乙醇（500ul）混匀（巅倒30次）→12000r/min离心→弃上清→重新用75％乙醇处理一次→打开EP管盖放入50℃烘箱，干燥DNA→无酒精味，放入TE40ul溶解DNA。PGEM218质粒与PET32a质粒载体的酶切及片段回收单双酶切反应体系（一）双酶切体系30ulPEGM218（PET32a）23ulEcoRⅠ0.5ulXhoI0.5ul10×Tangobuffer6ul(二)单酶切反应体系30ulPEGM218（PET32a）23ulEcoRⅠ0.5ul10×Tangobuffer2ulH2O4.5ul37℃水浴大于3h(3~4h)琼脂糖电泳：6ul酶切反应液+2ul溴芬兰，6ulMAC+2ul溴芬兰对照。电泳30min,EB染色15min,观察。中间为MAC,左边两条为PEGM218,右边PET32单双酶切都出现两条DNA条带，且对应条带大小一致，说明质粒都能够被切开，可以进行下一步实验。实验步骤：（一）大量酶切：酶切体系60ulPGEM218（PET32a）46uLFCRI1uLXhoI1ul10×Tangobuffer12ul37℃水浴大于3h(3~4h)PGEM218与PET32a各做两个体系。(二)琼脂糖电泳：上样体积60ul，MAC对照。左边六条带是PEGM218酶切结果，中间四条是PET32酶切结果，右边是MAC(三)割胶回收1.将电泳完的胶放在紫外灯下，开启紫外灯，将胶上目的DNA片段放入称过重量的EP管中，每管中的胶块小于0.4克（400ul）2.向胶块中加入3倍体系重量的溶胶液（0.1克体系为100ul）50℃水浴10min。3．向吸附柱CA2中加入400ml平衡液静置2min,将CA2柱放入离心管中，12000r/min离心1min，弃平衡液。4．将溶胶液移入CA2柱中（如溶胶液体体积大可分多次加入，每次加满即可），在37℃水浴中保温5min,12000r/min离心1min,弃去液体。5.向CA2柱中加入500ul漂洗液,12000r/min离心1min,弃洗液。6.向吸附柱CA2中加入500ul漂洗液静置2min,12000r/m离心1min,弃洗液。7.将CA2柱于37℃培养箱中放置10min.8.CA2柱放入新的干净EP管中，加入50ul已经在水浴中预热的洗脱液，于55℃水浴中静置10min,12000r/min离心2min,收集DNA溶液。编号12345678910EP管重g0.8620.9440.9430.8720.8450.8790.8570.9420.8760.898总重g1.0011.081.0660.9991.031.0641.0611.1311.0531.068溶胶液ul41.740.636.938.155.455.461.156.853.151.1重组表达载体的构建以及转化连接反应体系10ulT4DNAligase1ulT4DNAligasebuffer1ulPEGM218基因片段6ulPET32a片段4ul12℃连接过夜转化实验：200ul感受态→加入1ul质粒混匀→42℃水浴90s→迅速拿出置于冰浴2min→加入800ulLB培养基→37℃，220rpm振荡培养1h→分别取出10ul、20ul、40ul涂板，每组涂两个。培养待出现单菌落，挑取单菌落平板划线培养。快速裂解检测菌落挑取平板上的菌落于5ul无菌水中打散→加入25ul2×crinkingbuffer→混匀→离心（12000rpm,5min）→上清液点样电泳，染色观察。实验过程中现象与结果记录：8min:14min:15min:27min:53min: