抑菌试验方案

一、实验材料的制备（一）病虫害的制备1、病虫害的采集本实验所用材料分病原菌及害虫两类。其中病原菌分别从宣木瓜和丹皮两种地道药材植物上采集。宣木瓜的病原菌本实验室已有，并且提取了单一菌种。丹皮方面需要我们查阅资料以及请教师姐，把握最佳采集时间和采集类型，然后我们进行实地考察以及集采。采集丹皮根部，连同根部泥土带回。害虫方面，我们将到野外筛选采集。2、病原菌的纯种分离2.1培养基的制备根据实验需要制备培养病原菌所需培养基，主要为牛肉膏蛋白胨培养基（用来培养细菌）、PDA培养基（用来培养真菌）。2.2病原菌稀释平板计数2.2.1.制备病原菌悬液将带有土壤的丹皮烂根放入锥形瓶中，加入9ml无菌水中，振荡20min，让菌充分分散，静置5min.2.2.2编号取无菌平皿9套，分别用记号笔标明10-4、10-5、10-6各3套。另取6支盛有9ml无菌水的试管，排列于试管架上，依次标明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。2.2.3稀释用1ml无菌吸管精确地吸取1ml病原菌悬液放入10-1的试管中，注意吸管尖端不要碰到液面，以免吹出时，管内液体外溢。然后仍用此吸管将管内悬液来回吸吹三次，吸时伸入管底，吹时离开水面，使其混合均匀。另取一支吸管自10-1试管吸1ml放入10-2试管中，吸吹三次，……其余依次类推。2.2.4取样用3支1ml无菌吸管分别精确地吸取10-4、10-5、10-6的稀释菌液0．2ml，对号放入编好号的无菌培养皿中。2.2.5倒平板于上述盛有不同稀释度菌液的培养皿中，倒入溶化后冷却至45℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基约10—15ml，置水平位置，迅速旋动混匀，待凝固后，倒置于37℃温室中培养。0．2ml菌液对号接种于不同稀释度编号的培养皿中的培养基上，再用无菌玻璃刮棒将菌液在平板上涂布均匀，平放于实验台上20—30分钟，使菌液渗透入培养基内，然后再倒置于37℃的温室中培养。2.3划线法分离2.3.1、倒平板将加热融化的牛肉膏蛋白胨培养基和马铃薯蔗糖培养基分别倒平板，并标明培养基的名称。2.3.2、划线在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取经稀释10倍的土壤悬液-环在平板上划线(图Ⅴ-3)。划线的方法很多，但无论哪种方法划线，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使形成单个菌落。常用的划线方法有下列二种：⑴用接种环以无菌操作挑取病原菌悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线3-4条，再转动培养皿约70°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同法通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线(图Ⅴ-4，A)。划线完毕后，盖上皿盖，倒置于温室培养。⑵将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线(图Ⅴ-4，B)。划线完毕后，盖上皿盖，倒置温室培养。（二）丝瓜伤流液的制备丝瓜生长旺盛时选粗大健壮的植株，从离地面约80cm处剪断，插入到备好的瓶中，塞紧瓶口，将瓶绑扎固定，收集的液体过滤，放阴凉处备用。二、病虫害的鉴定选取长有单菌落的培养皿，接种至试管斜面培养。常规鉴定的内容有形态特征和理化特性。形态特征包括显微形态和培养特征；理化特性包括营养类型、碳氮源利用能力、各种代谢反应、酶反应和血清学反应等。三、试验方法（一）平板抑菌试验（真菌）将丝瓜伤流液过滤除菌，定量加在PDA培养基中配制成平板，对照组分别在培养基中加入域丝瓜伤流液等量的无菌水。真菌在PDA平板上培养5d，自菌落边缘用灭菌打孔器取直径4.5mm的圆形菌块，移到制备好的含伤流液的平板中央，25℃培养，测量菌落半径，根据测量结果计算抑菌率。（二）抑菌实验———滤纸片法（细菌）1、菌悬液制备将供试菌种在各自适合的斜面培养基上和适宜的温度条件下(细菌37℃,霉菌28℃)于培养箱中培养活化(细菌24h,霉菌48h),备用。将活化后的供试斜面培养基用10mL无菌生理盐水稀释制成含菌量为106～108个/mL的菌悬液。2、丝瓜伤流液滤纸片的制备及处理细滤纸,用钢笔套按一个圆印,剪下(一次剪4个),尽量剪圆。置于三角瓶中,塞上棉塞,高压蒸汽灭菌后浸泡于丝瓜伤流液中,2h后用无菌镊子夹出,在瓶口沥去多余丝瓜伤流液,即可贴入刚接种的器皿上。贴入时标记起始位置,按顺时针或逆时针方向将滤纸片顺序贴入。3、抑菌试验分别将配制好并已经灭菌的各种固体培养基趁热分别倒入无菌培养皿中,每皿15～20mL(各皿量要相同),冷却凝固后用吸管吸取0.3mL被试菌液,加到平皿上,用涂布棒涂布均匀。将灭菌的丝瓜伤流液滤纸片用无菌镊子夹取风干,放在含菌平板上,每皿3片,每种处理丝瓜伤流液做3次重复。细菌置于37℃培养24h,霉菌置28℃培养48h,测定滤纸片的抑菌圈直径大小,比较抑菌效果。