拟南芥突变体的筛选与鉴定综述

本科生文献综述题目拟南芥突变体的筛选综述系别林学与园艺学院班级园艺102班姓名唐辉学号103231228答辩时间年月新疆农业大学林园学院拟南芥突变体的筛选综述唐辉指导老师：王燕凌摘要：本文归纳了拟南芥抗旱、抗氧化、耐低钾、耐硒、耐盐、晚花突变体筛选的研究内容。在拟南芥抗旱突变体筛选中将用到甘露醇模拟干旱胁迫来进行试验。在抗氧化、耐低钾、耐硒中将用到Na2SeO3、钾、硒、NaCl等化合物或者化学元素对拟南芥突变体的生长发育影响来进行拟南芥突变体的筛选。概括了拟南芥突变体在甘露醇模拟干旱中的生长影响以及拟南芥突变体在抗氧化、耐低钾、耐硒、耐盐等逆境环境中生长研究方面的观点。总结了拟南芥突变体在先如今人们研究中常用的几种筛选方法，指出了拟南芥突变体筛选的研究需求，并提出筛选拟南芥抗逆突变体的重要意义。关键词：拟南芥；突变体；筛选；研究ScreeningSummaryofArabidopsisMutantsTangHuiInstructor:WangYanlingAbstract:ThispapersummarizestheArabidopsisdrought,oxidationresistance,lowpotassium,selenium-resistant,salt,late-floweringmutantscreeningresearch.AnddetailedexpositionofthevariousmaterialsandprocessesArabidopsismutantscreeningmethodsneededinthescreeningprocess.Intheanti-oxidation,anti-potassium,seleniumresistancewillbeusedNa2SeO3,potassium,selenium,NaClchemicalelementsorcompoundssuchmutationsaffectthegrowthanddevelopmentofthebodytobescreenedArabidopsisthalianamutants.ThussummarizesthegrowthofArabidopsismutantsmannitolandsimulateddroughtinArabidopsismutantsinanti-oxidation,anti-potassium,seleniumresistancepointofview,saltandotheradverseenvironmentsgrowresearch.Arabidopsismutantssummarizedearlierresearchthatpeoplenowcommonlyusedinseveralscreeningmethods,pointedouttheArabidopsismutantscreeningresearchneedsandtheimportanceofscreeningproposedresilienceofArabidopsismutants.Keywords:Arabidopsis；Mutant；Filter；Research拟南芥（Arabidopsis）为十字花科(Cruciferous)、拟南芥属（Brassicaceae、Arabidopsis）一年生或二年生的细弱草本植物。它是分子生物学研究的模式植物，它的完整基因组已被成功测定。近年来拟南芥以其个体小、生长周期短以及基因组小等特点而成为分子遗传学研究的模式植物。拟南芥突变体的筛选已成为许多重要理论问题得以解决的前提，而筛选方法是突变体筛选成败的关键。鉴于拟南芥在遗传操作上所具有的优势，它已广泛应用于植物整个生命活动各个过程的研究，为新基因及基因功能等方面的研究提供了很多依据。1.拟南芥抗旱突变体的筛选张娇娇[1]在拟南芥突变体的筛选研究中采用不同浓度的甘露醇模拟干旱胁迫，以发芽率为筛选指标在拟南芥突变体库中筛选抗旱突变体，筛选出2株候选突变体，最终得到1株稳定突变体vem1，通过表型和生理生化鉴定，确定为抗旱突变体。该研究为抗旱基因克隆及功能分析奠定基础，对于揭示植物抗旱的分子机理具有重要的理论意义。实验所用拟南芥（Arabidopsis）生态型为Columbia，野生型(WT)和突变体（Mutant）来自美国拟南芥种质资源中心[2]，实验采用2种方法培养植株[3-4]。分别是培养基培养与土壤培养，而培养基培养的方法是将种子经0.1％Hgcl2消毒3min后，用无菌水冲洗4～5次，然后将种子点种在加入1.5％蔗糖和0.8％琼脂的培养基中；并用封口膜封装于4℃条件下处理2d后转至光周期16h光/8h暗、光照100μmol·m-2·s-2温度22～23℃的培养室。土壤培养是将幼苗移至装有混合好的灭菌营养土的盆钵中，置于光周期16h光/8h暗、光照100μmol·m-2·s-2、温度22～23℃的培养室内，移栽和开花时各浇1次营养液，并根据植株生长需要浇以适量水。土壤培养是将种子播种于装有灭菌土的盆钵中，浇含有不同浓度甘露醇的营养液，置于光周期16h光/8h暗、光照100μmol·m-2·s-2、温度22～23℃的培养室内培养。确定抗旱突变体的筛选浓度将野生型拟南芥种子分别点在甘露醇浓度为250、300、350、400mmol/L的MS培养基上，每个浓度3个培养皿，每个培养皿中播种50粒种子，成5×10矩阵，水平放置培养。经过4℃冰箱黑暗2d春化、光照培养7～10d后，记录发芽率。以野生型几乎不能发芽或者发芽不能存活的甘露醇浓度为临界筛选浓度。再以确定的筛选浓度配制培养基进行筛选。培养皿中央点野生型种子作为对照，其余部分点突变体种子，水平放置培养。定期观察并拍照，若有能生长的突变体幼苗，作为候选突变体，将之移栽到土壤中培养。2.拟南芥耐硒突变体的筛选慈凌坤[5]在拟南芥耐硒突变体筛选研究中采用不同质量浓度的亚硒酸钠(Na2SeO3)对拟南芥突变体库中的2121株拟南芥进行筛选,筛选出29株候选突变体，最终得到2株稳定突变体vse1和vse2，通过表型鉴定和生理生化鉴定确定是突变体。该研究为耐硒基因克隆及功能分析奠定了基础,对于揭示植物耐硒的分子机理具有重要的理论意义。实验所用材料是拟南芥(Arabidopsis)生态型为Columbia,野生型(WT)和突变体(Mutant)来自美国拟南芥种质资源中心。实验采用2种方法培养植株：①培养基培养:种子经0.1%HgCl2消毒3min后用无菌水冲洗4～5次，将种子点种在1.5%蔗糖和0.8%琼脂的培养基中；并用封口膜封装,于4℃条件下处理2d后转至光照为100μmol·m-2·s-2、温度为22～23℃的培养室中。②土壤培养：种子播种于装有土壤的盆钵中，置于光周期为光照16h,黑暗8h、光照为100μmol·m-2·s-2、温度为22～23℃的培养室内,播种和开花时各浇1次营养液,并根据植株生长需要浇以适量水。通过培养实验确定50mg/LNa2SeO3为筛选质量浓度后。在普通MS培养基上点种，育苗7d后移入50mg/LNa2SeO3选择培养基，以根长作为筛选指标,选择根长明显长的作为候选突变体。3.拟南芥耐低钾突变体筛选3.1不同钾浓度的低倍钾对拟南芥生长的影响蒋春运[6]为了探讨筛选耐低钾突变体的最优条件，比较了5种琼脂粉(糖)及不同钾浓度的低钾培养基对拟南芥生长的影响。结果表明:添加SeakemLEagarose培养基的钾离子浓度为43.07Lmol/L；钾离子浓度在60、80、100、120、160μmol/L时,拟南芥弯根长度显著或极显著高于在40Lmol/L时，因此40Lmol/L左右可作为耐低钾突变体的筛选标准。植物材料为Wassileskija生态型的拟南芥。基本培养基为1/2MS培养基，筛选培养基为含有不同琼脂粉(糖)的MS低钾培养基和含不同钾离子浓度的MS培养基。5种琼脂粉(糖):AgarD、AgarB为BioBasicUSAInc生产，普通琼脂粉为北京奥博星生物技术有限责任公司生产，SeakemLEagarose为瑞士LonzaE生产,Invitrogenagarose为美国invitrogen生命技术公司生产。在实验过程中首先要对种子消毒、播种与培养条件次氯酸钠表面消毒15min(期间多次颠倒混匀)，再用无菌水冲洗5～6遍。播种前种子与0.15%(m/v)琼脂糖混和，然后用吸管将种子吸出,成行地播种于1/2MS培养基上；将培养皿置于4℃冰箱春化2d,之后转入培养室中光照培养，培养皿垂直放置。待根长至2cm时,将拟南芥幼苗转移至相应的低钾培养基上倒置培养，观察拟南芥根的弯曲情况。培养室温度22～24℃，照条件：16h光照,8h黑暗,光强100μmol·m-2·s-2。不同品牌的琼脂粉(糖)钾离子含量的测定方法5种不同琼脂粉或琼脂糖各称取0.25g放进坩埚中,在马弗炉中首先在300℃中灰化2h，然后再500℃灰化10h，灰分用硝酸溶解,加纯净水定容到10mL，用火焰光度计进行钾离子含量的测定。每个样品3个重复。拟南芥根生长测定方法将根长2cm的拟南芥幼苗分别转移到含有5种琼脂粉(糖)的低钾培养基上，培养基中的钾由琼脂粉(糖)提供。倒置培养,培养条件同上。10d之后观察测定幼苗的弯根长度，比较拟南芥在不同琼脂粉(糖)低钾培养基上的生长情况。每处理3个重复，每个重复16株拟南芥幼苗。根据上述结果选择合适的琼脂粉(糖)用于配制低钾培养基，外加KNO3调节钾浓度，分别配成总钾离子浓度为40、60、80、100、120、140、160、180μmol/L的低钾培养基。将根长2cm的拟南芥幼苗从1/2MS培养基转移到含不同钾离子浓度的低钾培养基上,倒置培养，6d之后统计幼苗弯根长度。每个浓度处理3次重复，每个重复16株幼苗。3.2利用甲基磺酸乙基（EMS）处理拟南芥种子赵淑清[7]利用经甲基磺酸乙酯(EMS)诱变处理的拟南芥种子，接种于MS培养基上，垂直放置培养4天后,将幼苗转移至胁迫培养基中，以倒置幼苗180°所形成的弯曲生长根作为指标筛选拟南芥耐营养胁迫突变体利用这种方法，成功地筛选到一个耐低钾的隐性单基因拟南芥突变体。以拟南芥(Arabidopsisthalianacv.Landsbergerecta)为材料，对植物体进行诱变，诱变方法如下：称取250mg(约5000粒)野生型种子置于50ml烧杯内并加入25ml重蒸水，搅拌30分钟；在4℃下放置12小时后，把种子转移到盛有30ml100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.5)的100ml三角瓶中，加入0.2%(v/v)的甲基磺酸乙酯(EMS)，封口后放在水浴(25℃)振荡器上振荡12h。然后用50ml蒸馏水漂洗种子4次,每次15min。将漂洗好的种子置于4℃下春化3天后种植。将经EMS诱变处理后的拟南芥种子(M1)播种于用1/4Hoagland营养液浸透的混有蛭石的营养土中(营养土:蛭石=2:1，v/v)，种植后覆盖塑料薄膜以保持湿度。在温度18～22℃光照强度120μmol/m2·s1、光暗周期16h/8h条件下培养，待种子成熟后分行采收种子(M2代)。将所收种子进行培养、接种并筛选出所需要的植株。具体方法有以下三点（1）基本培养基:：MS培养基，1.0%琼脂(w/v)，pH5.7。选择培养基(实验是去钾培养基)：大量元素(单位mg/L)NH4NO32350，NH4H2PO4144，CaCl2-2H2O440，MgSO4·7H2O370，微量元素同MS培养基，去K+琼脂1.2%(w/v)，蔗糖3%(w/v)，pH5.7(Tris-HCl调节)。（2）接种方法：与培养条件拟南芥种子用0.5%(v/v)次氯酸钠加0.1%(v/v)Tr-itonX-100表面消毒10分钟,再用无菌水冲洗3遍。接种前种子与0.4%(w/v)低熔点琼脂糖混和，然后用吸管将种子吸出，成行地涂于MS培养基上；将培养皿置于4℃冰箱春化48小时