探究植物组织培养的一般过程

探究植物组织培养的一般过程摘要：为了探究植物组织培养的一般过程以及继代培养建立组织培养再生体系，本次实验采用不同的培养基培养离体组织。结果表明，不同的培养基所培养出的愈伤组织，其诱导率和污染率有所不同；而在继代培养中，幼芽分化率，生根率也存在差异。关键词：植物组织培养、继代培养、诱导率、污染率、幼芽分化率、生根率植物组织培养技术是指采用植物无菌培养技术，根据植物细胞具有全能性的理论，将离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体,在无菌和适宜的人工培养基及光照、温度等人工条件下，能诱导出愈伤组织、不定芽、不定根,最后形成完整的植株的过程[1]。植物组织培养技术自Habedandt提出植物细胞全能性理论以来，至今已有100年的历史，现在植物组织培养技术已在科研和生产中广泛应用，成为最引人注目的生物技术之一。本次实验采用不同的培养基对离体组织进行培养，以探究植物组织培养的一般过程与适宜的培养条件。1材料与方法1.1材料烟草、太阳花、大岩桐、非洲紫罗兰1.2试剂与设备95%乙醇、70%乙醇、10%NaClO、1g/L的HgCl2，0.1%新洁尔灭、1mol/LNaCl或HCl；高压灭菌锅，解剖刀，三角烧瓶（100mL），烧杯，量筒，培养皿，棉线，超净工作台，分析天平，镊子，容量瓶，移液管，牛皮纸。1.3方法与步骤1.3.1配置培养基母液按照配方[2]，将大量元素配制成10倍的母液2000mL；将铁盐配置成100倍的母液200mL；将有机物配置成100倍的母液200mL；将2，4-D、NAA、6-BA配置成浓度为0.5mg/mL的母液各400mL。1.3.2配置培养基各小组的培养基分别为（1）MS+2,4-D2.0mg/L；(2)MS+2,4-D0.5mg/L+NAA0.2mg/L；(3)MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L；(4)MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L；(5)MS+6-BA2.0mg/L；(6)MS+6-BA0.1mg/L+2,4-D0.5mg/L；(7)1/2MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L；(8)MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L+0.1%AC(活性碳)。根据所需配制的培养基用量，按照下列公式及所需的各种母液的扩大倍数，分别计算出需吸取各母液的数量。吸取量=需要配制培养基的体积×（需要配制浓度/母液浓度）1.3.3培养基灭菌将配好的培养基加入3%蔗糖、07%卡拉胶加热溶解，调至pH=6.0，趁热分装于100mL三角烧瓶中。待培养基冷却凝固后，用一层称量纸和一层牛皮纸包扎瓶（管）口，并用棉线扎牢，然后在高压灭菌锅中121℃（1kg/cm2）下灭菌20min。取出三角烧瓶放在台子上，冷却后备用。接种操作所需的一切用具（如长镊子、解剖刀、剪刀等）及灭菌水，需同时灭菌。刚灭过菌的培养基在室温下放置2-3d,经检查没有杂菌生长污染，方可使用。1.3.4外植体的消毒及其接种除去植物材料中不需要的部分，将有需要的部分置自来水龙头下流水冲洗几分钟；然后在无菌坏境中将材料放入75％洒精中浸泡30秒，再用无菌水漂洗；最后将材料移入10%NaClO或1g/L的HgCl2中消毒10-15分钟，再用无菌水漂洗。用无菌纸吸干水分后，置于经灭菌处理过的培养皿中，用无菌的解剖刀将材料切成0.5cm³的小块，再用无菌镊子把组织小块接种至盛有不同培养基的果酱瓶中。1.3.5愈伤组织的诱导将上述接种有外植体的果酱瓶置于组织培养室内进行培养，定时观察外植体的生长变化或污染情况，并在培养一段时间后统计外植体的污染率以及其愈伤组织的诱导率。污染率（%）=污染的材料数/总接种材料数×100%诱导率（%）=形成愈伤组织的材料数/总接种材料数×100%1.3.6愈伤组织的分化在超净工作台上，将长势相近的愈伤组织分别转接入愈伤组织芽分化和根分化培养基中，并置于最适且相同的温度、光照条件下培养，逐日记录愈伤组织的形态变化，数周后统计愈伤组织的幼芽或幼根的分化率。幼芽分化率（%）=生芽的愈伤组织块数/接种愈伤组织总块数×100%生根率（%）=生根芽的愈伤组织块数/接种愈伤组织总块数×100%2结果与分析表1第一次初代培养结果记录表组别材料种类材料总数（块）污染率(%)出愈率(%)1大岩桐烟草非洲紫罗兰61261002510007502大岩桐非洲紫罗兰1616251007503大岩桐非洲紫罗兰248100500504大岩桐非洲紫罗兰96801002005大岩桐非洲紫罗兰1616751002506非洲紫罗兰1650507大岩桐烟草无菌烟草苗1616281005085.705014.38非洲紫罗兰61000从表一可以看出，第一次的初代培养，总体的污染率较大。一般来说，在植物组织培养过程中，培养基和培养材料都有可能滋生杂菌，导致培养失败。造成此现象的原因可能有三种：第一，由于外植体种类、取材的季节、时间、初代接种选取大小不适宜而导致所用材料的本身带有杂菌；第二，接种前器皿的灭菌不彻底和本次实验所采用对外植体进行消毒的试剂--10%NaClO其消毒效果较差，接种时操作室灭菌以及超净工作台出现问题，操作人员呼吸或身体、衣物上带有杂菌；第三，实验人员较多，出入培养室观察、记录培养结果的次数也多，容易导致培养环境的不清洁。针对以上可能造成污染的原因，采取了以下对应的措施，进行了第二次的初代培养。问题对应措施材料的本身带菌或外植体的消毒不彻底采用消毒能力较强的消毒剂--1g/L的HgCl2，适当延长消毒时间操作室灭菌以及超净工作台出现问题紫外灯接种室消毒的时间加长,实验前清洗超净工作台操作人员呼吸或身体、衣物上带有杂菌接种人员接种时用0.1%新洁尔灭喷洒双手,接种时禁止说话,接种的材料、工具不能超出工作台面,接种人员身体应尽量远离台面,接种时应穿上实验服表2第二次初代培养结果记录表组别材料种类材料总数（块）污染率(%)出愈率(%)1烟草太阳花96100100002烟草太阳花121201005003烟草太阳花2012332067804烟草太阳花69501005005烟草太阳花824100750256烟草1625507太阳花3225758太阳花81000表3继代培养结果记录表组别材料种类材料总数（块）污染率(%)芽分化率(%)根分化率(%)1烟草500402烟草605003烟草3501001004烟草9663306烟草605025生长素类的主要作用是重新启动有丝分裂,使已停止分裂的植物细胞恢复分裂能力[3]。不同植物种类对生长素的浓度反应不同，对多数植物材料的培养而言,2，4-D是生长素中诱导愈伤组织最有效的物质。在0.2-2.0mg/L的浓度范围内，2，4-D的作用随着浓度的增加而增强,较高浓度的2,4-D对组织培养再生芽的诱导和再生非常有效[4]。但是在本次实验中，第一组所得的出愈率为0，可能造成污染的原因如前面所分析。第三、四、六组的出愈率明显高于第五组，这说明了细胞分裂素在诱导愈伤组织的时候,和生长素配合使用,可以增强其诱导作用和效果。活性炭能吸收潜在的有害物质包括植物细胞分泌的酚类物质,从而减轻培养物的褐变[5]，但第八组得两次初代培养实验都失败，可能的原因有两个：一、操作不当引起污染；二、活性炭的用量不当，而其本身又具有强的吸附能力,导致培养基内有效物质的浓度降低,从而影响实验结果。3讨论本次实验通过进行两次的初代培养和一次继代培养，探讨了植物组织培养的一般过程。而在探究其培养的适宜条件这方面，尚有不足。理论上，在愈伤组织的诱导、器官发生和增殖过程中,细胞分裂素和生长素的比例是非常重要的[6],当细胞分裂素含量高时产生不定芽,反之,产生不定根或愈伤组织[7]。在本次实验中，有部分数据可以证明这一观点；但是由于操作过程出现的问题较多，所以仍有部分数据存在不合理的地方。参考文献：[1]胡彦,赵艳.植物组织培养技术的应用以及在培养过程中存在的问题.陕西师范大学报,2004,32:1302134.[2]潘瑞炽.植物细胞工程.广东高等教育出版社[M],2006，2:23[3]张彦妮.影响植物组织培养成功的因素.北方园艺，2006,3:132～133[4]LiuGS,LiuJS,QiDM,ChuCCeta1.FactorsAffectingPlantRegenerationfromTissueCulturesofChineseLeymus(Leymuschinensis).PlantCellTiss.Org.2004,76:175～178.[5]TANGHR,RENIL,ReustleG,etal.PlantRegenerationfromLeavesofSweetandSourCherryCultivars.ScientiaHorticulturae,2002,93:235～244.[6]RamageC.,WilliamsR.R.MinerallqutritionandPlantMorphogenesis.InVitroCell.Dev.Biol.Plant.2002,38:116～124.[7]张红晓,经剑颖.木本植物组织培养技术研究进展.河南科技大学学报(农学版),2003,23(3):66～69.