掺锶聚磷酸钙共培养成骨细胞与内皮细胞行为和功能蛋白的变化

中国组织工程研究第18卷第3期2014–01–15出版ChineseJournalofTissueEngineeringResearchJanuary15,2014Vol.18,No.3ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH365彭红，女，1987年生，湖北省天门市人，汉族，2013年四川大学毕业，硕士，主要从事生物材料研究。通讯作者：余喜讯，副教授，四川大学高分子科学与工程学院，四川省成都市610065doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.03.006[]中图分类号:R318文献标识码:A文章编号:2095-4344(2014)03-00365-06稿件接受：2013-10-24PengHong,Master,SchoolofPolymerScienceandEngineering,SichuanUniversity,Chengdu610065,SichuanProvince,ChinaCorrespondingauthor:YuXi-xun,Associateprofessor,SchoolofPolymerScienceandEngineering,SichuanUniversity,Chengdu610065,SichuanProvince,ChinaAccepted:2013-10-24掺锶聚磷酸钙共培养成骨细胞与内皮细胞：行为和功能蛋白的变化彭红，顾志鹏，黄程程，徐源廷，余喜讯(四川大学高分子科学与工程学院，四川省成都市610065)文章亮点：1前期实验发现掺锶聚磷酸钙材料对于单独培养的内皮细胞和成骨细胞的行为有显著促进作用。文章的创新在于首次从分子水平探讨掺锶聚磷酸钙对共培养下成骨细胞与脐静脉内皮细胞行为和功能蛋白表达的影响。2文章的特点在于首次发现成骨肉瘤细胞与内皮细胞共培养于掺锶聚磷酸钙后，掺锶聚磷酸钙上调了细胞血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子蛋白水平的表达。今后将对血管初期成型方面进行进一步研究，使体系更完善。关键词：生物材料；骨生物材料；掺锶聚磷酸钙；内皮细胞与成骨细胞共培养体系；血管内皮生长因子；碱性成纤维细胞生长因子主题词：生物相容性材料；磷酸钙类；锶；内皮细胞；成骨细胞摘要背景：前期实验发现掺锶的聚磷酸钙材料对单独培养内皮细胞或成骨细胞的行为有显著促进作用。目的：观察掺锶聚磷酸钙对共培养下成骨细胞与脐静脉内皮细胞行为和功能蛋白表达的影响。方法：取第3代人脐静脉内皮细胞与人成骨肉瘤细胞MG63以2∶1的浓度比接种于24孔板中，然后再分别加入掺锶聚磷酸钙、聚磷酸钙与羟基磷灰石，共培养7d后。采用ELISA法检测细胞血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子蛋白的表达，采用MTT法检测细胞活性。结果与结论：与聚磷酸钙与羟基磷灰石相比，在掺锶聚磷酸钙表面生长的细胞呈现更加良好的形态，细胞融合生长形成单层覆盖在材料表面，并且在材料表面有一定的跨度生长，说明掺锶聚磷酸钙材料能促进内皮细胞在其上黏附、伸展，有利于细胞的生长和增殖。掺锶聚磷酸钙组细胞分泌的血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子明显高于聚磷酸钙组和羟基磷灰石组(P0.05)，说明掺锶聚磷酸钙可上调血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子蛋白的表达。彭红，顾志鹏，黄程程，徐源廷，余喜讯.掺锶聚磷酸钙共培养成骨细胞与内皮细胞：行为和功能蛋白的变化[J].中国组织工程研究，2014，18(3):365-370.Effectsofstrontium-dopedcalciumpolyphosphateonbehaviorandangiogenicgrowthfactorsexpressionofco-culturedosteoblastsandendothelialcellsPengHong,GuZhi-peng,HuangCheng-cheng,XuYuan-ting,YuXi-xun(SchoolofPolymerScienceandEngineering,SichuanUniversity,Chengdu610065,SichuanProvince,China)AbstractBACKGROUND:Ourpreviousstudieshaveshownthatstrontium-dopedcalciumpolyphosphatecontaininglow-dosestrontiumappearstohaveasignificanteffectonangiogenesis-relatedbehaviorsofmonoculturedumbilicalveinendothelialcellsandosteoblasts.OBJECTIVE:Toinvestigatetheeffectofstrontium-dopedcalciumpolyphosphateonangiogenesis-relatedbehaviorsofumbilicalveinendothelialcellsandosteoblastsco-cultured,includingcelladhesion,spreading,proliferation,aswellastheproteinsecretionofvascularendothelialgrowthfactorandbasicfibroblastgrowthfactorfromco-culturesysteminvitro.METHODS:Humanumbilicalveinendothelialcellsandosteoblasticcells(MG63)wereutilizedinthisstudy.Cellsfrompassage3wereusedforpreparationofthecell-scaffoldconstructs.Afterplacedin24-wellplateataratioof2:1,humanumbilicalveinendothelialcellsandMG63cellswereseededontostrontium-dopedcalciumpolyphosphate,calciumpolyphosphateandhydroxyapatitescaffoldsandco-culturedfor7days.Thevascularendothelialgrowthfactorandbasicfibroblastgrowthfactorproteinlevelsweredeterminedthroughadoubleligandenzyme-linkedimmunosorbentassay.Thecolorimetric3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromideassaywasperformedtoquantifytheeffectofscaffoldsoncellproliferation.RESULTSANDCONCLUSION:Comparedwiththoseoncalciumpolyphosphateandhydroxyapatitescaffolds,cellsonstrontium-dopedcalciumpolyphosphatescaffoldsattachedandspreadbetterwithasignificantlyimprovedcellproliferation.Moreimportantly,thevascularendothelialgrowthfactorandbasicfibroblastgrowthfactorexpressionsweresignificantlyhigherinthestrontium-dopedcalciumpolyphosphategroupthantheothertwogroups(P0.05),indicatingstrontium-dopedcalciumpolyphosphatecanup-regulatelevelsofvascularendothelialgrowthfactorandbasicfibroblastgrowthfactorproteins.彭红，等.掺锶聚磷酸钙共培养成骨细胞与内皮细胞：行为和功能蛋白的变化P.O.Box10002,Shenyang110180(3):365-370.0引言Introduction骨组织工程的目标是用来修复大面积骨骼缺损。骨修复过程不仅是新骨的生长，还需要血循环重建，这样才能为新生骨组织中的细胞提供养分，排泄废物[1-2]，所以理想的骨组织工程支架材料应该具有促血管化功能。在早期骨折愈合过程中会出现缺损局部高能代谢状态，此时对血供及能量物质的需求提高[3-5]，因此在构建组织工程化骨组织的同时，促进小血管的长入及细胞与材料复合物内血供的重建就成为骨组织工程由基础向临床应用的关键性环节[6]。血管生成主要受到血管化生长因子的影响。在所有己知的血管化生成因子成员中，血管内皮生长因子是促血管生成作用最为特异而确切的因子，其在生理和病理性血管生成中都起着核心的调节作用[7]。碱性成纤维细胞生长因子在促血管生成过程中具有多效性特点，它是一种内源性多肽生长因子，同时是另一种最有效的促进血管生成因子，它通过提高成骨细胞的增殖和促进内皮细胞的生长来促进骨形成和血管化[8]。成骨细胞和内皮细胞在生长良好的状态下都可以表达血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子。然而，在新骨生长过程中诱导快速血管化的困难性成为骨组织工程应用于坏损组织更换的主要限制因素[9-10]。Pacicca等[11]研究发现成骨细胞与内皮细胞共培养，成骨细胞分泌的血管内皮生长因子量显著高于单一细胞组，同时有血管样结构形成。Hofmann等[12-13]发现成骨细胞与内皮细胞共培养于支架材料上能够生成血管样结构。共培养的成骨和内皮细胞之间通过复杂的相互作用控制着骨形成和血管化[14]，将两种细胞在支架材料上共培养是解决骨组织工程促血管化的一种有效途径。另一方面，支架材料在骨组织工程的血管化方面也起着重要作用。如果生物材料或组织工程支架材料自身具有诱导血管生成的生物活性，就可以刺激移植或迁移到支架材料上的细胞释放血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子，然后与成骨细胞和内皮细胞的共培养体系相结合，将会增加在新骨生长过程中诱导快速血管化的可能性。锶是一种具有促进骨形成和减少骨吸收双重作用的骨组成元素[15-17]，同时锶元素能有效提高材料的生物相容性和生物活性。聚磷酸钙是一种具有优良机械性能和生物相容性的生物陶瓷骨组织工程材料，在骨修复方面受到广泛关注[18-19]。前期实验发现掺锶聚磷酸钙材料对于单独培养的内皮细胞和成骨细胞的行为有显著促进作用[20-21]。实验在3种不同支架材料掺锶聚磷酸钙、聚磷酸钙和羟基磷灰石上将成骨细胞与内皮细胞以一定比例共培养，研究掺锶聚磷酸钙支架材料对共培养体系的细胞行为和血管内皮生长因子，碱性成纤维细胞生长因子表达的影响及机制。1材料和方