干旱胁迫对玉米幼苗生理生化指标的影响

干旱胁迫对玉米幼苗生理生化指标的影响XXX，云南昆明呈贡650500摘要对植物产生伤害的环境称为逆境，又称胁迫。常见的逆境有寒冷、干旱、高温、盐渍等。逆境会伤害植物，严重时会导致植物死亡。逆境对植物的伤害主要表现在细胞脱水、膜系统受破坏，酶活性受影响，从而导致细胞代谢紊乱。植物在长期的适应过程中形成了各种各样抵抗或适应逆境的本领，称为抗性。在生理上，以形成胁迫蛋白、增加渗透调节物质（如脯氨酸含量）、提高保护酶活性等方式提高细胞对各种逆境的抵抗能力。干旱、盐碱和低温是强烈限制作物产量的三大非生物因素,其中干旱造成的损失最大,其损失超过其他逆境造成损失的总和。本实验以玉米幼苗为材料，设置对照组（未经过干旱处理），探究了干旱胁迫下脯氨酸（pro）、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、H2O2的含量变化以及抗氧化酶(POD、PPO)活性的变化。实验通过分光光度计分别在不同的波长中测出吸光率，间接计算出其含量及酶活性，进而通过对正常条件下的和逆境胁迫下一定量玉米苗体内以上各种物质含量的对比，从而了解玉米体内生理生化指标发生的变化。结果表明：在干旱胁迫下，脯氨酸（pro）、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、H2O2的含量相对于对照组均有较明显的上升趋势，POD和PPO活性也表现出较大水平的提高。也说明了玉米苗在干旱条件下既有对植物抗旱不利的物质增加，也有增强抗旱性和保水性的物质的含量增加以维持植物的生命力。关键词玉米苗，干旱胁迫，抗逆性，紫外分光光度计吸光率，抗氧化酶引言干旱是自然界常见的逆境胁迫因素，干旱也是植物最容易受到的胁迫之一。干旱不仅制约植物的生长生理与产量的高低，也会引起植被结构与功能的空间变化。因此，植物对干旱胁迫的适应及机制一直是植物逆境适应策略研究的一个热点。植物对干旱胁迫的适应过程和受伤害程度与干旱胁迫的强度以及植物自身的抗性联系紧密，并从生理代谢、生理功能、形态适应、生长发育以及生物生产力等多种形式表现出来。土壤有效水分状况与植物之间的关系也是植物生理生态学研究领域的热点问题。大多数植物在短期或轻度土壤缺水情况下叶片水势下降，气孔关闭。限制CO2摄取和光合作用速率，长期严重干旱条件下可限制植物生长,引起形态结构发生变化（如萎焉，枯黄、干瘪等）。甚至导致植物死亡。研究表明，游离的脯氨酸在植物细胞抵抗非生物胁迫过程中扮演着越来越重要的角色，许多新的生理功能也逐渐被发现，近几年来有关脯氨酸的研究倍受科学工作者的关注。脯氨酸作为水溶性最大的氮基酸，具有较强水合能力，是理想的渗透介质。作物遇旱时它的大量积累有助于细胞或组织保水，防止脱水，维系生命，故可视为作物对干早环境的一种保护性适应。已经有科学家证明了在逆境条件下脯氨酸的积累用来抵抗植物对非生物胁迫的伤害，植物体内的抗氧化酶系统也能将伤害细胞的活性氧控制在可适应水平内，通过各种过氧化酶的协同作用，可以把细胞内产生的具有很强氧化活性的活性氧如氧负离子、H2O2等直接或间接地清除，防止了活性氧放大耦联作用，保证了细胞内生命活动的正常进行。丙二醛（MDA）和可溶性糖是由于植物器官衰老或在逆境条件下受伤害，其组织或器官膜脂质发生过氧化反应而产生的，对干旱也具有抵抗作用。GSH是体内重要的抗氧化剂和自由基清除剂，在生物体抵抗各种胁迫(冷害、干旱、重金属、真菌等)的过程中起着重要的作用，其含量水平的高低与植物对各种环境胁迫的忍耐程度密切相关。近些年来，它在高等植物代谢过程中的生理作用，尤其是在植物抵御活性氧伤害过程中的作用及其与植物抗逆性关系的研究进展很快。在正常生长情况下,活性氧的产生和清除处于动态平衡状态。当植物在逆境条件下(如干旱胁迫)生长时,这种平衡被打破,体内负责清除活性氧的抗氧化系统能力下降,从而造成活性氧的大量积累,并引发或加剧膜脂过氧化作用,导致生物膜系统受损。过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶（PPO）、过氧化物GSH(谷胱甘肽)等能够有效地清除这些自由基,也是酶促防御系统的重要组成成分。玉米在干旱胁迫下具有独特的生存策略,是一种公认抗逆性较强的作物,本次实验我们利用干旱胁迫处理玉米幼苗,测定其丙二醛(MDA)含量、可溶性糖含量、GSH含量、脯氨酸含量、H2O2含量及PPO、POD活性变化,除此之外我们还测量了玉米及小麦种子的生理活性。探讨干旱胁迫对玉米幼苗生理生化指标的影响,为进一步明确和了解玉米抗旱的生理机理提供一定实验依据。材料、方法和结果１、材料、试剂和仪器1.1玉米种子发芽率及生理生化指标的测定的材料培养和处理品种为晴3或鲁玉13的玉米种子（购于西山种子公司）→用0.1%HgCl2消毒10min后→用蒸馏水漂洗干净→用蒸馏水于26℃下吸涨12h→播于垫有6层湿润滤纸的带盖白磁盘（24cm×16cm）中→于26℃下暗萌发60h→计算发芽率（注意与前面结果比较）→选取长势一致的玉米幼苗做干旱、高温、盐渍或低温下处理（去除较矮或较高的玉米幼苗）。1.2试剂和仪器主要试剂：0.1%HgCl2，TTC，3%磺基水杨酸（SSA），冰乙酸，茚三酮，PBS(pH=7.8)，0.6%TBA（用0.6%TCA配制），PBS(pH=6.8，内含1mMHA)，0.1%Ti(SO4)2[用20%(v/v)H2SO4配制]，PBS,（pH=5.8,内含0.１mmol/LEDTA,1%PVP），POD反应混合液（10mmol/L愈创木酚，5mmol/LH2O2,用PBS溶解），PPO反应混合液（20mmol/L邻苯二酚，用PBS溶解）5%三氯乙酸，PBS(pH=7.7)，4mMDTNB(用0.1MpH=6.8PBS现配)。主要仪器：分光光度仪，离心机，试管，微量加样器，研钵等。2、方法2.1种子发芽率的测定：所采用的种子发芽率的测定方法是曙红染色法和TTC染色法。凡是有生命活力的种子胚部，在呼吸作用过程中都有氧化还原反应，而无生命活力的种子胚则无此反应。当TTC渗入种胚的活细胞内，并作为氢受体被脱氢辅酶（NADH2或NADPH2）上的氢还原时，便由无色的TTC变为红色的TTF。用曙红染色的，凡是全部着色或胚已着色的种子表示失去了生活力,播后不能发芽，生活力强的种子是不会着色的,因为活细胞具有半透性膜,可防止染料分子通过而不着色，死亡细胞,其壁膜失去半透性,染料分子易进入,使原生质着色。各取50粒吸胀的玉米种子或小麦种子→沿胚的中心线切成两半（严格区分两个半粒），进行下列实验：其中50个半粒进行TTC染色（30℃水浴20min）另50个半粒进行曙红染色（室温染色10min）根据两种方法的染色情况，分别计算发芽率。公式如下：种子发芽率=有生命的种子/测试种子数X100﹪2.2脯氨酸含量的测定用茚三酮法测定脯氨酸含量，在酸性条件下，茚三酮与脯氨酸反应生成红色化合物，在520nm下有最大吸收值。分别取0.1g实验组和对照组的胚芽鞘→加入3mL3%磺基水杨酸（SSA）和少许石英砂→充分研磨→用2mL3%SSA洗研钵→5000rpm离心10min→上清液定容至5mL。上清液各2mL→分别加入2mL冰乙酸和2mL茚三酮试剂→煮沸15min→冷却后→5000rpm离心10min→分别测定A520。Pro的提取：分别取0.1g实验组和对照组的胚芽鞘→加入3mL3%磺基水杨酸（SSA）和少许石英砂→充分研磨→用2mL3%SSA洗研钵→5000rpm离心10min→上清液定容至5mL。测定：上清液各2mL→分别加入2mL冰乙酸和2mL茚三酮试剂→煮沸15min→冷却后→5000rpm离心10min→分别测定A520。计算公式如下：2.3可溶性糖和MDA含量测定用硫代巴比妥酸法测定丙二醛含量。分别取0.1g实验组和对照组→加入3mL50mMPBS(pH=7.8)和少许石英砂→充分研磨→用2mLPBS洗研钵→5000rpm离心10min→上清液定容至5mL。测定：分别取上清液各2mL→加入0.6%TBA（用0.6%TCA配制）2mL→煮沸12min→冷却后→5000rpm离心10min→分别测定OD450和OD532.计算公式：OD450=C1×85.4OD532=C1×7.4+155000×C2求解方程得：C1/（mmol/L）=11.71OD450C2/（mol/L）=6.45OD532－0.56OD450式中，C1为可溶性糖的浓度，C2为MDA的浓度。2.４H2O2含量测定H2O2提取：分别取0.1g实验组和对照组→加入3mL50mMPBS(pH=6.8，内含1mMHA)和少许石英砂→充分研磨→用2mLPBS洗研钵→5000rpm离心10min→上清液定容至5mL。测定：分别取上清液各3mL→加入0.1%Ti(SO4)2[用20%(v/v)H2SO4配制]1mL→摇匀→5000rpm离心10min→OD4102.5抗氧化酶活性的测定用愈创木酚法测定POD活性，用邻苯二酚法测定PPO活性。在有过氧化氢存在的条件下过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，可用分光光度计测量其含量，进而计算POD的活性。多酚氧化酶能使邻苯二酚氧化生成醌，用比色法测量其产物的形成，进而计算出PPO的活性。计算公式如下：POD测定：取POD反应混合液（10mmol/L愈创木酚，5mmol/LH2O2,用PBS溶解）3.00ml，加入酶液100ml（空白调零用PBS取代），立即记时，摇匀，读出反应3min时的A470。PPO测定：取PPO反应混合液（20mmol/L邻苯二酚，用PBS溶解）2.8ml，加入酶液0.2ml（空白调零用PBS取代），立即记时，摇匀，读出反应2min时的A410。以每分钟A值变化0.01所需要的酶液的量为一个活力单位（U），则计算公式如下：2.6GSH的含量测定GSH的提取：分别取0.1g实验组和对照组的胚芽鞘→加入3mL5%三氯乙酸（TCA）和少许石英砂→充分研磨→用2mL5%TCA洗研钵→5000rpm离心10min→上清液定容至5mL。测定：上清液各1mL→分别加入1mL0.1MPBS(pH=7.7)→0.5mL4mMDTNB(用0.1MpH6.8PBS现配，空白用此PBS代替)→25℃5min→测定A412。计算公式如下：３、结果分析3.1种子发芽率的测定：实验后的结果如下表：种子总数为玉米、小麦各50粒实验方法ＴＴＣ法薯红法实验材料玉米小麦玉米小麦实验项目＋＋――＋＋――＋＋――＋＋――结果记录33174733416428＋＋：有活力的种子――：无活力的种子根据公式：种子发芽率=有生命的种子/测试种子数X100﹪计算种子发芽率ＴＴＣ法：玉米：发芽率＝有生命的种子/测试种子数X100﹪=33/50X100﹪=66%小麦：发芽率＝有生命的种子/测试种子数X100﹪=47/50X100﹪=94%薯红法：玉米：发芽率＝有生命的种子/测试种子数X100﹪=34/50X100﹪=68%小麦：发芽率＝有生命的种子/测试种子数X100﹪=42/50X100﹪=84%根据结果得到下图：分析：根据上图数据显示，通过TTC法和薯红法得到的结果是：玉米的发芽率比较接近，且种子的活性高；小麦的发芽率差别较大，造成这种情况的原因主要是种子切好之后，没有把种子搅拌均匀的缘故。3.2脯氨酸含量的测定实验后测得520nm下的紫外分光值如下：实验组为结果干旱处理的玉米苗；对照组为未结果干旱处理的玉米苗（下同）项目实验组对照组Ａ5200.6310.163根据公式计算结果：ɛ=3.24μmmol-1.cm-1L=1cmW=0.1gV显=6mLV总=5mLV用=2mL实验组：脯氨酸含量=29.21mmol.g-1FW对照组：脯氨酸含量=7.54mmol.g-1FW根据结果得下图表：项目实验组对照组脯氨酸含量29.21mmol.g-1FW7.54mmol.g-1FW分析：根据上图显示，干旱玉米苗内的脯氨酸含量明显高于正常的玉米苗，并且是正常苗的4倍还多。其原因主要是：脯氨酸是水溶性较大的氨基酸，具有很强的水合能力，其水溶液具有很高的水势。脯氨酸的疏水端可与蛋白质结合，亲水端可与水分子结合，蛋白质可借助脯氨酸束缚更多的