干细胞与表观遗传

骨髓间充质干细胞分化与表观遗传方面的研究综述摘要骨髓间充质干细胞是最早被分离定义的间充质干细胞，具有多向分化的潜能，骨髓间充质干细胞成骨分化，成脂分化，向心肌细胞分化，向神经细胞分化过程中，不仅有传统研究中的转录调控因子的表达的改变，还存在表观遗传修饰变化。本文对此进行了综述。关键词骨髓间充质干细胞表观遗传DNA甲基化干细胞分化19世纪中叶，骨髓里的细胞被发现具有成骨能力，1966年Friendenstein等[1]观察到这类细胞可在体外培养贴壁生长。以后干细胞研究飞速发展,早期因分离培养的MSCs具有成纤维细胞样形态而被称为集落形成单位成纤维细胞,后又称为间充质祖细胞,现通常称为MSCs。报道最多的是骨髓来源的MSCs,此外,MSCs还可从脐血、胎盘、羊水、脐静脉内皮下层、外周血及肌肉等组织中分离得到。骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能，在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。目前间充质干细胞（骨髓间充质干细胞）的研究已超越了临床前阶段，骨髓间充质干细胞用于心肌修复、骨再生和关节修复的临床试验已处于测试中。表观遗传（epigenetics）是指DNA序列不发生变化，但基因表达却发生了可遗传的改变。这种改变是细胞内除了遗传信息以外的其他可遗传物质发生的改变，且这种改变在发育和细胞增殖过程中能稳定传递。在间充质干细胞分化过程中，不仅有传统意义上的转录因子的表达水平的改变，也有表观遗传修饰上的变化。本文对，骨髓间充质干细胞成骨分化，成脂分化，向心肌细胞分化，向神经细胞分化中的一些涉及表观遗传的研究进行了综述。1间充质干细胞向成骨细胞分化目前我们已经明确知道间充质干细胞具有多向分化潜能，但是其向多种组织细胞分化的机理我们还没有搞清楚，搞清楚其向各类细胞分化的机制，从而使我们有可能调节间充质干细胞按照我们预定的目标定向分化，在临床上将为多种疾病的治疗提供可能。在关于间充质干细胞成骨分化的研究中，发现分化机理不仅涉及传统的转录因子的调节作用，表观遗传修饰在间充质干细胞的成骨分化中也起着重要作用。张晓雷等用DNA甲基化抑制剂——5-氮胞苷研究了DNA甲基化对MSCs成骨分化的影响，他们发现，在诱导将充质干细胞成骨分化前用DNA甲基化抑制剂——5-氮胞苷研对间充质干细胞进行处理，能显著促进间充质干细胞的成骨分化水平。成骨分化重要调控基因Dlx5在间充质干细胞成骨分化中受表观遗传修饰调控。DNA甲基化抑制剂——5-氮胞苷研能显著改善成骨分化调控基因Dlx5的表达水平，进而影响间充质干细胞的成骨分化水平。HOX家族基因作为一类转录因子,在胚胎发育以及细胞分化过程中发挥着十分重要作用。其在间充质干细胞向成骨细胞分化的过程中的表达水平有明显改变，一系列的研究已经表明,在间充质干细胞的成骨分化过程中,HOX家族基因表达受到抑制,而这种抑制作用是与其分化过程中发生的染色质重塑事件密切相关的。通过体外定向诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,对比分化前后细胞中HOX家族基因的表达状况,发现HOX家族基因的表达水平在hMSCs早期成骨分化过程中显著下降.进一步的研究发现,HOX家族基因的这种表达变化是由其启动子区的组蛋白H3-Lys9乙酰化和二甲基化水平发生变化而导致的.Runx2(Runt-relatedtranscriptionfactor2)也是参与成骨细胞分化与骨形成的重要转录因子之一，最近的一系列研究表明，Runx2的表达也受表观遗传修饰的调控。如胡晓青等人的研究发现，Runx2的启动子区域在间充质干细胞的成骨分化中存在表观遗传修饰，其DNA甲基化水平和组蛋白乙酰化水平在间充质干细胞成骨分化过程中存在显著变化，BMSCs在成骨诱导分化中Runx2的mRNA表达在3d达到高峰,之后下降;同时在BMSCs成骨分化第3d,与转录激活相关的组蛋白修饰乙酰化H3K9和三甲基化H3K4均升高;而与转录抑制相关的组蛋白修饰三甲基化H3K9降低.另外检测还显示,Runx2启动子区域乙酰化H3K9和三甲基化H3K4募集增加,而三甲基化H3K9募集降低.Runx2启动子区域DNA甲基化修饰程度降低。目前，发现的与间充质干细胞成骨分化有关的基因很多，为弄清这些基因在间充质干细胞成骨分化过程中表达水平的变化是否与表观遗传修饰有关，我们常常通过在间充质干细胞成骨分化诱导培养中加入一些表观遗传修饰的抑制剂，然后检测目的基因的表达水平，对表达水平变化明显的目的基因的表观；遗传修饰水平做进一步检测，黄洁等在探索骨髓间充质干细胞的成骨分化过程中的DNA甲基化修饰的改变时，就采用了这种策略，并成功鉴定出PRMT5基因在间充质干细胞成骨分化过程中的表达水平的变化受到表观遗传修饰的调控，并且认为PRMT5基因的表达不利于间充质干细胞的成骨分化。在最近的研究中发现中药能影响骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的表观遗传修饰变化的，杨锋等人研究了左归丸对骨髓间充质干细胞成骨分化相关基因甲基化的影响，他们的研究发现左归丸含药血清可通过去甲基化的表观遗传调控机制促进BMSCs向成骨细胞分化。但是该试验证明左归丸的药物分子能对骨髓间充质干细胞成骨分化的表观遗传修饰产生影响，是在体外条件下。所取含药血清来自服用药物的小鼠。而且研究者只测了骨髓间充质干细胞的基因甲基化水平，因此对此药在体内作用时，骨髓间充质干细胞微环境与此药物的系统的相互作用缺乏数据，但该试验提供了一条研究间充质干细胞成骨分化的重要思路，表明了中药可能在骨髓间充质干细胞成骨分化研究中的价值。黄艳丹等则研究发现VPA可能在骨髓间充质干细胞向软骨分化过程中起到类似于生长因子FGF-2的作用，也有可能是通过抑制组蛋白去乙酰化酶活性改变染色体结构暴露FGF-2等转录因子结合位点开启相关基因的转录表达，从而促进软骨细胞的分化。2间充质干细胞向心肌细胞的分化诱导。间充质干细胞是具有多向分化潜能的成体干细胞，能在多种诱导条件下形成心肌细胞。尽管诱导方式很多，但间充质干细胞向心肌细胞分化的机理仍没弄清楚。从现有研究看，间充质干细胞向心肌细胞的分化是受多条信号通路协同影响的，而且受表观遗传修饰调控的影响。而且可以预测，随着研究的进一步扩展，将会发现更多具有调控作用的基因和信号途径，发现更多受表观遗传修饰的基因在间充质干细胞向心肌细胞分化的过程中出现表观遗传修的变化。目前已经发现的在间充质干细胞向心肌细胞分化过程中其重要作用的信号通路有ＢＭＰ通路、ＦＧＦ通路、Ｎｔｏｃｈ通路、Ｓｍａｄｓ通路、Ｗｎｔ通路等，其中研究的比较透彻的是Ｗｎｔ信号通路，其被认为在心脏发育过程中其关键作用。另外不断发现的与间充质干细胞向心肌细胞分化有关的基因是否受表观遗传修饰调控也受到关注，比如ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、ＭＥＦ－２Ｃ等与干细胞向心肌分化相关，是其重要的启动基因，而且改变相关基因的表观遗传特性（如乙酰化、甲基化和磷酸化等），可诱导干细胞向心肌细胞分化。但是具体哪个信号通路，哪个分化基因起关键作用仍未明确，各信号通路如何相互作用也未明确。这些都有待进一步探索。而且，人们更希望找到某些在间充质干细胞向心肌细胞分化过程中的关键基因或者调控网络中的关键节点，但是从目前的研究进展来看，工作量和难度都非常大。随着间充质干细胞向心肌细胞分化过程中的越来越多的信号通路，表观遗传修饰位点，小分子物质等被发现，利用生物信息技术来研究其分化机理，寻找某些可能的靶基因将会普遍起来，这些方面的研究都将会成为热点。余细勇等曾用与sD大鼠乳鼠心肌半透膜共培养的方法诱导BMSCs向心肌细胞分化,诱导后的心肌样细胞可有节律地搏动，表明非细胞接触的心肌微环境也能直接诱导BMSCs分化为心肌细胞,。ＢＭＰ是转化生长因子（ＴＧＦ）家族一员。ＢＭＰ－２、成纤维细胞生长因子（ＦＧＦ）和胰岛素样生长因子（ＩＧＦ）在心脏的发育中起重要作用。研究表明，联合应用ＦＧＦ－１，ＩＧＦ－１和ＢＭＰ２能够诱导间充质干细胞形成心肌样细胞。陆续有其它诱导方式比如利用物理因素如电磁场，化学因素如５－氮杂胞苷报道成功将骨髓间充质干细胞诱导成了心肌样细胞，但是间充质干细胞能否诱导成心肌细胞仍存在质疑。因为前述一系列研究只是将干细胞诱导成了心肌样细胞，具有心肌细胞的某些功能或形态特点，但是并不具有心肌细胞的完整功能。这些都需要后续实验来进一步阐明。3骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的研究。目前，骨髓间充质干细胞分化为神经细胞的研究并不是热点，很多研究都集中在IPS细胞向神经细胞分化的研究。但骨髓间充质干细胞分化为神经细胞的研究仍取得许多成果，李海生等人把骨髓干细胞诱导的神经细胞注射入患有老年性痴呆症的大鼠的脑部海马组织，显著改善了患有老年性痴呆症的大鼠的学习记忆能力。张轶等也做过类似的研究，他们将骨髓间充质干细胞诱导得到的神经元样细胞移植到具有认知障碍的大鼠脑组织内也得到了类似的结果。张英等研究了骨髓间充质干细胞向神经细胞分化过程中的DNA甲基化状态的变化。他们将从大鼠骨髓分离得到的间充质干细胞培养至第四代然后用BHA/DMSO诱导第四代MSC向神经细胞分化，并检测了MSC、MSC分化神经细胞和脑组织三组的oct4、Tau和NSE启动子区甲基化状态。结果发现MSC、MSC分化神经细胞和脑组织的oct4启动子区甲基化修饰百分比7.8%、8.75%和78.6%,各组之间无明显差异。Oct4启动子区一123bp的CPG在MSC维持低甲基化状态(1.1%),明显低于脑组织(71.4%)和MSC分化神经细胞(50.0%)。Tau和NSE启动子区在MSC分化前后和脑组织中均保持未甲基化状态,组间无差异。这表明间充质干细胞向神经细胞分化的过程中Tau和NSE呈去甲基化状态，而Oct4基因甲基化增强。靳久增等则研究了间充质干细胞向神经细胞分化过程中，组蛋白乙酰化与去乙酰化的变化，他们用组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸参与诱导间充质干细胞向神经细胞的分化结果发现丙戊酸能够具有诱导骨髓间充质干细胞分化成神经样细胞的能力,并且其增强了Oct-4在BMSCs体外定向诱导分化中的表达。4骨髓间充质干细胞的成脂分化成骨细胞和脂肪细胞共同来源于骨髓间充质干细胞(BMSCs),BMSCs的成骨与成脂分化存在相互制约的平衡关系,一旦该平衡被打破,便会引起代谢相关疾病或发育异常。近年来的一系列研究表明脂肪组织的生长发育，肥胖症的产生等都涉及DNA甲基化水平的变化。吴伟等研究了乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素TSA(TricostatinA)对间充质干细胞C3H10T1/2成脂分化的影响及可能的机制。他们发现C3H10T1/2细胞成脂分化的过程伴随着蛋白质乙酰化修饰的下降,增加蛋白质的乙酰化修饰水平可以抑制成脂分化;并且差异蛋白质组学研究揭示了成脂分化过程中蛋白表达谱的巨大变化。去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A（TSA）具有抑制间充质干细胞成脂分化的作用，龚雨琴等人研究的发现去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A（TSA）并不是通过抑制信号通路来抑制间充质干细胞的成脂分化。已有研究证实,SIRT1在前脂肪细胞分化中,不仅可以去乙酰化组蛋白,调控转录因子的转录活性；而且可以去乙酰化脂肪生成关键转录因子。此外,在MSCs细胞命运决定中,SIRT1可以促进MSCs的成骨分化,而抑制MSCs的成脂分化。周远飞等人的研究表明SIRT1通过调控Wnt信号通路,影响MSCs分化形成脂肪细胞的分子机制。：SIRT1对间充质干细胞命运选择具有决定性作用,激活SIRT1抑制了MSCs细胞的成脂定向,而抑制SIRT1则促进了MSCs细胞的成脂定向。其机制是一方面SIRT1通过去乙酰化Wnt信号的拮抗物启动子区域的组蛋白,抑制Wnt信号的拮抗物的表达,解除了对Wnt信号通路的拮抗,从而激活Wnt信号通路,抑制脂肪的生成；另一方面SIRT1通过去乙酰化Wnt信号的关键蛋白β-catenin,促进β-catenin在核内的积累,促进Wnt