实验7小鼠腹水瘤细胞裂解及乳酸脱氢酶活性检测

细胞生物学实验实验72015/4/27实验7小鼠腹水瘤细胞裂解及乳酸脱氢酶活性检测姓名：李思露学号：131140040一、实验目的1．了解裂解细胞的意义。2．了解及掌握哺乳动物细胞常用裂解方法及裂解效果检测方法。二、实验原理反复冻融、超声及去污剂处理均可导致细胞裂解。不同细胞裂解方法所产生的裂解效果及对细胞蛋白活性的影响不同。细胞裂解效果可通过形态学方法及胞内标志蛋白活性反映。乳酸脱氢酶（lactatedehydrogenase，LDH）为胞浆标志酶，稳定存在于几乎所有细胞的胞浆内。细胞膜破坏后，LDH即被释放到细胞外。定量检测细胞悬液离心后上清液中乳酸脱氢酶的活性即可反映细胞膜破碎的程度及对胞浆蛋白活性的影响。LDH检测原理：LDH催化底物形成可与显色剂反应生成有色化合物的产物，通过比色可显示酶活。三、实验材料、试剂及器材（一）材料：接瘤7天的荷腹水瘤小鼠。（二）试剂：1．0.01mol/L，pH7.2PBS。2．碧云天RIPA裂解液（强）。3．1%TritonX-100溶液：用PBS配制。4．乳酸脱氢酶（LDH）测试盒。（三）用品：普通台式离心机、-20℃低温冰箱、10mL刻度离心管、胶头吸管、CO2培养箱、96孔板离心机、96孔板、100μL枪及对应枪头等。四、实验操作1．准备腹水瘤细胞：抽出荷瘤小鼠腹水，用PBS将细胞浓度调整为1.0×106/mL。2．细胞裂解：（1）冻融：1.5mLEP管，0.5mL细胞悬液，-20℃冰箱及37℃水浴中反复冻融5次。（2）去污剂处理：0.5mL细胞悬液；1500r/min离心8min，弃上清。然后分别作如下处理：处理1：0.5mLPBS重悬细胞处理2：0.5mLRIPA裂解液重悬细胞，置4℃冰箱，分别在10、20、30min时取样制备装片观察细胞完整度。处理3：1%TritonX-100溶液重悬细胞，4℃静置30min3．LDH活性测定（1）离心收集上清：12000r/min离心5min，小心转移上清到干净的EP管。（2）反应：96孔细胞培养板内进行如下反应：a.20μL待测标本+25μL基质缓冲液+5μL辅酶Ⅰ，37℃温育15min；b.+2,4二硝基苯肼25μL，37℃温育15minc.+0.4mol/L氢氧化钠250μL，室温5min（3）测定吸光值：450nm测定OD。五、实验结果细胞生物学实验实验72015/4/271.0.5mLRIPA裂解液重悬细胞，置4℃冰箱，在10分钟时取样制备装片观察细胞完整度，在显微镜下观察到的视野如下图所示。图1RIPA裂解液重悬细胞，置4℃冰箱，在10分钟时观察到的细胞完整度2.LDH活性测定时加入0.4mol/L氢氧化钠250μL后在96孔板中的反应。图2LDH活性测定时加入氢氧化钠后在96孔板中细胞悬液变成棕褐色3.450nm测吸光值OD值的结果。姓名编号123李思露APBSTritonX-100溶液RIPA裂解液林静文BPBSTritonX-100溶液RIPA裂解液图3450nm测吸光值OD值的结果细胞生物学实验实验72015/4/27六、作业与思考题比较经PBS、RIPA裂解液、TritonX-100溶液处理后，LDH活性测定值的大小，查阅资料并解释。答：本组实验结果为，PBS的OD值为0.589和0.557，TritonX-100的OD值为0.494和0.465，RIPA裂解液的OD值为0.540和0.526。下通过单因素方差分析假设检验。假设检验为：H0：μ1=μ2=μ3（三种处理方式对细胞裂解无影响）H1：μ1、μ2、μ3不全相等（三种处理方式对细胞裂解不同或不全相同）PBS处理TritonX-100处理RIPA裂解液处理0.5890.4940.5400.5570.4650.526ni222均数0.5730.47950.533单因素方差分析表误差来源(Source)平方和(SS)自由度(df)均方(MS)检验统计量(F)处理效应SSA=0.0088032MSA=0.004401512.8136827误差SSE=0.00103053MSE=0.0003435总效应SST=0.00983355该F值分子的自由度组间=2，分母的自由度组内=3，查方差分析表得F0.05(2,3)=9.55，F＞F0.05(2,3)，则P＜0.05。拒绝H0，接受H1，故可认为三种处理方式对细胞裂解有差别。三组数据表面看起来相差不大，但通过方差分析可知，三种处理方式是不完全相同的。经查阅资料知，PBS溶液对细胞裂解几乎没用作用，TritonX-100是一种去污剂，加速细胞裂解，RIPA裂解液(强)的主要成分为50mMTris(pH7.4)，150mMNaCl，1%TritonX-100，1%sodiumdeoxycholate，0.1%SDS，以及2mMsodiumpyrophosphate，25mMβ-glycerophosphate，1mMEDTA，1mMNa3VO4，0.5ug/mlleupeptin等多种抑制剂，除了有去污剂的作用外，还有效抑制蛋白降解。所以理论上，RIPA裂解液处理的细胞LDH的活性及含量最高，其OD值也最高，TritonX-100溶液处理的次之，PBS处理的居末。而本组的实验结果却显示PBS的OD值最高，其次是RIPA裂解液处理的，最后才是TritonX-100处理的，与理论值存在着较大的差异，分析可能是由实验中的某些操作不规范造成的。由图1可以看出，RIPA裂解液重悬细胞10分钟后视野中观察不到完整的细胞，故推知此时细胞已经裂解。由图2可以看出，在加入NaOH后，LDH显色棕褐色，此时已经可以看出用TritonX-100处理的颜色较浅，与后来测定的OD值最小相符。经过图1、图2的分析，我们可以初步推断，其操作错误集中在LDH活性测定的前几步。由于当时实验室条件所限，被迫使用了敞口放置已久的NaOH溶液，其与空气中的二氧化碳发生反应，成分已经发生改变，推测主要是这个原因对最后的结果产生影响。七、反思与改进1．裂解样品的所有步骤都需在冰上或4℃进行。2．重悬细胞时应剧烈震荡EP管，使细胞裂解充分。3．应使用新鲜配置的试剂。