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实验九差示分光光度法测定维生素B1片的含量一、实验目的1.掌握差示分光光度法的基本原理。2.熟悉标准曲线定量的操作方法。二、实验原理(一)差示分光光度法(简称△A法),它保留了通常的分光光度法简便、快捷、直接读数的优点,又无需事先分离,并能消除干扰。方法:取两份相等的供试液,分别制成两种不同的化学环境(如在其一中加酸或碱,改变pH或在其一中加能与供试品发生某种化学反应的试剂),然后将它们稀释至同样浓度后,分置于样品池和参比池中,于适当波长处,测定吸光度的差值(△A)。应用条件:①供试品在不同的化学环境中以不同的分子形式存在,它们的吸收光谱有显著的差异;②干扰物的吸收不受测定时化学环境的影响,光谱行为不变。定量依据:设x、y分别代表在两种不同的化学环境中供试品的存在形式,它们在测定波长处的吸光度以Ax、Ay表示,背景和干扰的吸收度以AZ表示,AZ不受测定时化学环境改变的影响。根据吸光度加和性原则:即在供试液的一定浓度范围内△A值与其浓度C呈线性关系,并消除了AZ的干扰,可用标准曲线法或对照法定量。(二)维生素B1片的测定维生素B1分子中具有共轭双键结构,在紫外区有吸收,其紫外吸收随溶液pH的变化而变化。在pH7的磷酸盐缓冲液中具有两个吸收峰,在232~233nm处,%11cmE=345;在266nm处,%11cmE=255。在pH2时,最大吸收在246nm处,%11cmE=425。可用于维生素B1片的差示分光光度法的测定。三、实验方法(一)测定波长的选择精密称取维生素B1100mg,用水溶解并稀释成100ml,精密量取2ml二份,分别用缓冲液(pH7.0)和盐酸液(pH2.0)稀释成100ml,以相应溶剂为空白,测定紫外吸收光谱。再将前者放于参比池,后者放于样品池,绘制差示吸收光谱(见图11)。差示光谱图表明在247nm处有最大差示吸收值(△A),确定247nm为测定波长。(二)标准曲线绘制精密称取干燥至恒重的维生素B1100mg,置100ml量瓶中,用水溶解并稀释至刻度,摇匀,作为贮备液。精密量取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml贮备液各二份,分别置100ml量瓶中,一份用缓冲液稀释至刻度;另一份用盐酸溶液稀释至刻度,摇匀。取上述五组浓度相同,pH不同的溶液,在247nm处分别测定差示吸收值(△A)。以浓度C为横坐标,以差示吸收值△A为纵坐标绘制标准曲线或进行回归,求得回归方程和相关系数。(三)样品测定取本品20片,精密称定,研细。精密称取适量粉末(约相当于维生素B150mg),置50ml量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇匀,滤过,弃去初滤液,精密量取续滤液2ml二份,分别置100ml量瓶中,分别用缓冲液和盐酸液稀释至刻度,摇匀。将前者置参比池中,后者置样品池中,在247nm波长处测定差示吸收值。由标准曲线求得维生素B1,浓度,计算维生素Bl片的标示量%。本品含维生素Bl(C12H17ClN4OS·HCl)应为标示量的90.0%~110.0%。四、注意事项1.由于仪器波长可能存在差异,所给测定波长仅供参考,可照“测定波长的选择”项下自行测定。2.测定标准系列各细溶液的△A时,一定要遵循先稀后浓的原则,尽可能消除测定误差。五、思考题1.差示分光光度法的优点是什么?2.差示分光光度法是怎样消除干扰的?
本文标题:实验九差示分光光度法测定维生素B1片的含量
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