实验二细菌的形态观察(简单染色法和革兰氏染色法)

实验二细菌的形态观察（简单染色法和革兰氏染色法）一目的要求1．了解简单染色法和革兰氏染色法的基本原理，熟练掌握细菌的涂片与革兰氏染色技术。2．初步学习细菌细胞特殊结构的染色方法，并观察细菌的特殊结构。3．观察细菌的菌落平板，学会识别大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌的菌落特征，学会初步鉴别微生物的种类的方法。二实验内容与原理1．简单染色法原理简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法，一般用于观察个体形态与细菌排列。由于细菌在中性、碱性或弱酸性环境中带负电荷，所以通常采用一种碱性染料如美蓝、碱性复红、结晶紫对细菌进行染色。美蓝是美蓝的盐酸盐，可解离为带正电荷的美蓝，很容易与细菌结合使菌体着色。染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。简单染色过程：涂片→固定→染色→水洗→干燥→镜检涂片→固定→干燥→水洗、吸干→镜检→染色1mim2．革兰氏染色法原理革兰氏染色法是由丹麦医生HansChristianGram于1884年创立。它是细菌学中很重要的鉴别染色法，因为通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G－）两大类。革兰氏染色过程：涂片→固定→结晶紫初染（1min）→碘液媒染（1min）→乙醇脱色（95%酒精,30s）→番红复染（30秒）→干燥→镜检阳性菌：紫色阴性菌：红色革兰氏染色要点：（1）初染：用结晶紫，染色1分钟，水洗。（2）媒染：加碘液覆盖1分钟后水洗。（3）脱色：连续滴加95％乙醇，约30秒，直到滴下的乙醇无色为止，水洗。（4）复染：加番红染色1分钟，水洗。（5）干燥。（6）镜检：先低倍镜，后油镜观察。注意：涂片要薄而均匀，脱色程度要控制得当。学生做大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，枯草杆菌的革兰氏染色。观察细菌个体形态与排列，绘图。3．芽孢染色原理细菌的芽孢壁比营养细胞壁厚，致密，透性差，着色和脱色都比营养细胞困难，故一般采用一种碱性染料并在微火上加热，或延长染色时间，使菌体和芽孢都染上颜色以后水洗或稀酸冲去菌体的染料，芽孢仍保留颜色，再用另一种对比鲜明的染料使菌体着色，如此可明显区分芽孢和营养体结构。操作方法：（1）用枯草杆菌涂片、干燥、固定。（2）在涂菌处滴加5％的孔雀绿染液，用木夹夹住玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但不沸腾5－6分钟。加热时应添加染料，以免蒸干。水洗。（3）0.5％番红复染1分钟，水洗，烘干，镜检（芽孢绿色，菌体红色）。4．荚膜染色原理荚膜与染料亲和力低。在用简单染色法时，可以辨认出来。而通过荚膜染色也可以把它和细胞区别开来。操作方法：（1）涂片，晾干。（2）用Tyier氏醋酸结晶紫溶液染色2分钟，再用20%硫酸铜溶液洗涤，水洗，用滤纸吸干、干燥。（3）镜检：荚膜染成浅红色，细胞呈紫红色。5．鞭毛染色法原理细菌鞭毛直径为10-12nm，超过了光学显微镜的分辨能力。所以染色时，不仅要使鞭毛染色，还要使一部分染料堆积在鞭毛上，加粗鞭毛的直径以便能观察。鞭毛染色的方法很多，但染色成功的关键一是必须使用新鲜培养、活动活泼的菌体进行染色；二是使用绝对无油的干净玻片，以便菌液流过玻片时能保持自然形态。细菌的运动性，可通过悬滴法制片观察。注意区分布朗运动和细菌本身的运动。操作方法：（1）载片的制备：经过严格清洗后，置于95%乙醇中浸泡，用时才取出，用火焰烧去酒精，立即使用。（2）菌种的制备：取已活化3-5代的变形杆菌（或枯草杆菌）接种于新制备的肉汤琼脂斜面，斜面下部最好有冷凝水，培养8-9h即可使用。（3）制片：在载玻片的一端滴一滴蒸馏水，挑取少许菌苔底部有水部分的菌体，将接种环悬放在水滴中片刻，再将载片稍倾斜，使菌液随水滴缓慢流到另一端，放平，晾干。（4）染色：滴加鞭毛染色液A，3-5分钟，小心水洗干净，然后滴加鞭毛染色液B，30-60秒，水洗，晾干。（5）镜检：菌体、鞭毛均为褐色。悬滴法：（1）在盖玻片上滴小半滴无菌水。（2）以无菌操作挑菌，接种环在水上轻点几下。（3）将盖玻片迅速翻转置于凹玻片上即可观察。6．菌落特征的观察注意细菌落形状、大小、颜色、光泽、透明度、干燥或湿润、粘稠度、隆起情况、边缘状况等等。三实验材料1．显微镜1台，载玻片数片，盖玻片数片。2．枯草芽孢杆菌和大肠杆菌。3．香柏油、二甲苯、察镜纸等。四实验报告1．绘出枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的个体形态图，并注明两菌的革兰氏染色的反应性。五思考题1.革兰氏染色法涂片要薄而均匀，脱色程度要控制得当，为什么？