实验大蒜细胞SOD的提取和分离

1实验五大蒜细胞SOD的提取和活力测定一、实验原理超氧化物歧化酶（SOD）是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。它可催化超氧负离子（O2-）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢。大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，通过组织或细胞破碎后，可用pH7.8磷酸缓冲液提取出。由于SOD不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。SOD酶活性测定原理：核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O2.－，当加入氮蓝四唑（NBT）后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成一种蓝色物质，在560nm波长下有最大吸收。当加入SOD时，可以使超氧自由基与H+结合生成H2O2和O2，从而抑制了NBT光还原的进行，使蓝色二甲月替生成速度减慢。通过在反应液中加入不同量的SOD酶液，光照一定时间后测定560nm波长下各液光密度值。二、材料和试剂1．提取试剂：（1）.新鲜蒜瓣（2）.0.05mol/L/0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）（3）.氯仿-乙醇混合液：氯仿:无水乙醇=3:5（4）.丙酮：用前需预冷至4-10℃2．测活试剂：（1）0.026mol/L蛋氨酸（Met）磷酸钠缓冲液准确称取L-蛋氨酸（C5H11NO2S，MW=149.21）0.3879g于100mL小烧杯中，用少量0.1mol/LpH7.8的磷酸钠缓冲液溶解后，移入100mL容量瓶中并用0.1mol/LpH7.8的磷酸钠缓冲液定容至刻度，充分混匀（现用现配）。4℃冰箱中保存可用1～2d。（2）7.5×10－4mol/LNBT溶液准确称取NBT（C4OH3OCl2N10O6，MW=817.7）0.1533g于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入250mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀（现配现用）。4℃冰箱中保存可用2～3d。（3）含1.0μmol/LEDTA的2×10－5mol/L核黄素溶液A液：准确称取EDTA（MW=292）0.00292g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解。B液：准确称取核黄素（MW=376.36）0.0753g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解。2C液：合并A液和B液，移入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，此溶液为含0.1mmol/LEDTA的2mmol/L核黄素溶液。4℃冰箱中保存可用8～10d。该溶液应避光保存，即用黑纸将装有该液的棕色瓶包好，置于4℃冰箱中保存。当测定SOD酶活时，将C液稀释100倍，即为含1.0μmol/LEDTA的2×10－5mol/L核黄素溶液。三、实验步骤1、组织细胞破碎：称取10g大蒜蒜瓣，置于研钵中研磨。2、SOD的提取：破碎后的组织中加入4倍体积（40ml）的0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8），继续研磨15min，使SOD充分溶解到缓冲液中，取一半体积于8000~10000rpm下离心10min，另一半55-60℃热处理15min后离心，取上清液，分别记录体积并留样1.5ml。3、除杂蛋白：上清液加入0.25体积的氯仿-乙醇混合液搅拌15min，5000rpm离心15min，得到的上清液为粗酶液。4、SOD的沉淀分离：粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，8000~10000rpm离心10min，得SOD沉淀。将SOD沉淀溶于0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）中（溶解时，住ml加入），未经加热变性的样品于55-60℃热处理15min，得到SOD酶液。5、SOD活力测定每个处理取5个洗净干燥好的微烧杯/玻璃试管编号，按表1加入各试剂及酶液，反应系统总体积为3mL。其中4，5号中磷酸钠缓冲液量和酶液量可根据试验材料中酶液浓度及酶活力进行调整（4号为Pi粗提酶，5号为丙酮沉淀）。各试剂全部加入后，充分混匀，取1号微烧杯置于暗处，作为空白对照，比色时调零用。其余4个微烧杯均放在温度为25℃，光强为4500Lux的光照箱内（安装有3根20W的日光灯管）照光15min，然后立即遮光终止反应。在560nm波长下以1号杯液调零，测定各杯液光密度并记录结果。以2、3号杯液光密度的平均值作为抑制NBT光还原率100％，对照测出其他酶液的光密度值。表1反应系统中各试剂及酶液的加入量（mL）试剂杯号磷酸钠缓冲液蛋氨酸（Met）NBT溶液酶液核黄素10.91.50.300.320.91.50.300.330.91.50.300.34（粗提酶）0.21.50.30.70.350.21.50.30.70.33结果计算1．560nm波长下各杯液的光密度（表2）表2测定数据列表杯号123452、3号平均值酶液量（mL）0000.70.7—光密度（OD560nm）02.SOD酶活力按下式计算：SOD的活性单位以抑制NBT光还原的50%为一个活力单位，按下式计算SOD活性：A＝(D1－D2)×VD1×B×W×50％式中各因子代表内容如下：A：为酶活力（酶活力单位：U/g）；V：为酶提取液总体积（mL）；B：测定样品用量（mL）；W：为样品鲜重（g）；D1：为2、3号杯液的光密度平均值；D2：为加入不同酶液量的各杯液的光密度值。四、作业与思考题:1．写实验报告2．超氧化物歧化酶（SOD）的应用有哪些3．酶活力单位的定义