实验室常规操作

一、实验室常规操作1.动物房温度应保持在摄氏18~29度之间，平均温度22度；我们动物房空调是统一控制的冬天在20~22度，夏天24度左右，不需另外调节。湿度应维持在30%~70%之间，夏天通常湿度较大，常达90%以上，此时应注意每天给动物房抽湿（打开抽湿机，注意抽湿机下面的蓄水盒，满了要把水倒掉）；冬天湿度较低时注意加湿，加湿器在冰箱上面。2.超净工作台的使用：每次使用前15min将紫外灯打开消毒，15min后关紫外灯，打开白日灯，将风速指示灯调到3-4格处，打开工作台玻璃门，可进行操作，操作完成后仔细清理工作台，用抹布擦净后，再用75%酒精喷台面消毒，关灯，将风速指示灯调到0，关好玻璃门。3.排风口：每个笼子都有一个进风口、排风口，以保证小鼠笼内空气质量及流通，故每次放入小鼠笼子时务必将笼子充分插入，保证进、排风口已插入笼内；其中右边为排风口，此排风口须至少一个月清理一次（注意不要把棉签的棉花头吸进去了），以防不畅或堵塞；4.地面：动物房地面应每周消毒一次，将84消毒液洒在中间地板上，然后用洗净的湿拖把将84拖开至地面每一处，特别要注意角落也要拖到；5.垫料：本实验室垫料为景达公司提供，需提前半月（只剩半袋时）找实验中心负责老师（彭老师）开具证明（签自己的名字）及领取条（签喻嵘），到储物室处领垫料，放置在二楼进实验室门口的房间内；6.饲料：本实验室饲料需在实验中心刘师傅处加工，同样需提前至少半月联系刘师傅确定日期并准备材料；普通饲料加工：20斤普通饲料配1斤鸡蛋、1包全脂奶粉；高脂饲料加工：20斤普通饲料配1斤鸡蛋、1包全脂奶粉、1斤猪油、1斤胆固醇。注意饲料加工也需在实验中心负责老师那开领取条才能找刘师傅领取，饲料加工完成刘师傅会通知去取，所以在送材料过去的时候别忘了留下自己的联系方式。另外，夏天天气较潮又闷热，饲料一次不要做多了，容易长虫子，最多50斤左右，或者根据小鼠数量计算一个或一个半月的量，成年小鼠约5g/日；7.垃圾：每次操作完，要清洁整理动物房，最后的垃圾及时扔掉，不能扔在实验室中心门外的大垃圾桶里，必须每次自己带到楼下的垃圾房内；8.记录：实验室内基本情况、仪器运行情况、动物饲养情况都应进行相应记录。二、小鼠的饲养1.喂养：每笼小鼠数量约5只，每周加水加食3-4次，保证槽内食物及饮水充足，饲料加工见上；饮水来源：用紫外灭菌后的水瓶接取蒸馏水给小鼠饮用（或用洗净的水瓶装好自来水，装在一个布袋子里再放入高压蒸汽灭菌锅里灭菌后）。注：高压灭菌锅使用方法，首先应在外锅内加入清水直至没过底下的加热圈，然后放入内锅，将要灭菌的物品放入内锅内，然后盖盖子，盖盖前请检查好盖子内的胶圈是否放好，盖时注意调好内锅位置，务必将盖子下的气管放入内锅内的那个小槽里面，然后盖紧锅盖，注意检查盖上的压力阀是否压下，检查完毕后插好电源插座，打开开关，因此压力锅无指示灯，请在打开开关后仔细聆听锅内动静，确保压力锅完好工作中；此锅不是自动断电的，所以最好在消毒过程中有人盯着，当然也可以估算好时间，一般半个小时左右开始上汽，上汽后不需急着关闭，待反复上汽15min后再关闭电源，拔出插座；待锅内水汽全部自动放出以后再打开盖子，取出物品，以免烫伤，物品取出后，将内锅取出，倒出外锅里的水，也可将灭菌锅底下的水龙头打开放出水，注意要将水倒（放）尽，以免外锅底的加热圈生锈影响使用寿命。2.换笼：小鼠笼子应3-4天更换，以保持小鼠生活环境舒适。换笼方法：操作者戴好口罩、手套，先取出需要换笼的小鼠笼子及干净的笼子，放在外面的操作台或桌子上，用75%的酒精将双手及笼子外周喷洒消毒，消毒后将笼子放进超净工作台内（超净工作台使用方法见上），打开笼子进行操作，操作过程中不要将小鼠及干净的笼子拿到工作台外，完成后盖好盖子，归置动物笼架内，脏的笼子先放置地上，待换完所有笼子后，将脏笼子的盖子、饮食槽分别堆放，笼子的脏垫料倒尽，用刷子在清水下刷洗干净后，放置一起以待泡笼；3.泡酸：泡酸的目的是为了泡笼子进行消毒，我们使用的是过氧乙酸，即将过氧乙酸1和2倒入容器内混至一起后，封口，静置24h后方可使用。因为需要24h后才能使用，所以最好在需要泡笼子前一天将酸配好静置。另外此酸有强烈的刺激味，可对皮肤及粘膜造成伤害，操作时注意防护。4.泡笼：将配置好的过氧乙酸用清水稀释至0.2%，然后将需要浸泡的笼子（包括盖子及饮食槽）放入稀释好的酸中浸泡至少30min以上，浸泡完成后将笼子取出沥干，整理好笼子放回动物笼架上晾干以备下次使用，注意每次使用前确保笼子已干燥。5.繁殖：小鼠性成熟早，5周龄雄鼠睾丸出现精子，45-60日龄性发育成熟。雌鼠20日龄后阴道皮肤逐渐变薄阴道开口，其阴道开口与卵巢机能活动相一致。一般雌鼠36-50日龄具有生殖能力。小鼠体成熟一般多为60-90天,是适宜的配种日龄。小鼠性活动可维持1年左右，作为种鼠使用时间一般为6-8个月,之后其繁殖能力下降,仔鼠质量越来越差。交配：可采取一夫一妻或一夫多妻形式交配，按照血糖高低及近亲关系交配，即血糖高的与高的配，同时要避免近亲交配；小鼠妊娠期约19-21天，其分娩多在夜间进行，产前不安，不停地整理产窝，故在产前1-2天需要给孕鼠换个干净的笼子，孕期换笼时注意不可手提孕鼠尾巴，或动作过大惊吓孕鼠，应利用食物槽小心移取孕鼠，以防流产。小鼠分娩后5天内不可更换新笼，否则母鼠易因不熟新环境要死仔鼠，应在5-7天后更换。哺乳期一般为18-23天，4周龄时可将仔鼠分笼编号，幼鼠或仔鼠性别主要从外生殖器与肛门的距离判定，近者为雌，远者为雄。另外，雌鼠肛门和生殖器之间有一无毛小沟，而雄鼠则在肛门和生殖器之间长毛。再者，雌鼠有比雄鼠明显很多的乳头。6.健康状况：动物外观是检查动物健康状况的一项常规工作。外观判断小鼠健康的标准是：①食欲旺盛；②眼睛有神，反应敏捷；③体毛光滑，肌肉丰满，活动有力；④身无伤痕，尾不弯曲，天然孔腔无分泌物，无畸形；⑤粪便黑色呈麦粒状。否则可予VitC、复合维生素B溶于饮用水中饮用，有伤痕时予红霉素软膏涂擦。7.小鼠的抓取：用右手拇指和食指捏住小鼠尾巴中部将小鼠提起，放在笼子的铁丝槽上，用左手拇指和食指迅速、准确的捏住小鼠的两耳后及颈背部皮肤，将小鼠提起，翻转左手掌，以左手掌心和中指夹住小鼠背部皮肤，使小鼠整个成一条直线，用左手无名指压住小鼠背部的皮肤，小指压住小鼠尾巴根部，松开捏住小鼠尾巴的右手拇指和食指。灌胃：将灌胃针连接在注射器上，吸入一定量的药液；操作前，大致量一下从口到胃的距离，估计灌胃针头插入的深度；左手捉持动物，使头部向上，右手持针，把灌胃针头的前端放进小鼠口腔，顺着上颚部插入咽部，顺咽后壁轻轻往下推，灌胃针会顺着食管滑入胃内，此时没有抵触感；用右手食指将针栓慢慢往下压，将注射器中的药液灌入小鼠胃中。灌胃体积一般为0.5ml/20g，最大体积为1.0ml/只。操作时注意动作轻柔，进针时如遇抵触感应退出重新进，不可蛮力推针。测血糖：测空腹血糖前注意撤食，撤食时应更换干净笼子，以防小鼠吞食垫料中残余饲料或粪便，影响血糖结果。一般空腹8小时，撤食不撤水。8小时后，准备好血糖仪及血糖试纸，将血糖试纸插入血糖仪小孔处，注意采血头朝外，调好血糖仪上血糖试纸的型号，固定小鼠尾巴，用左手捏住小鼠尾巴消毒后，找到尾部血管从尾巴下1/4进针，用采血针头沿针头方向平行刺入，拔出针头后可见血液渗出，若渗出不多，可用右手拇指及食指沿血管由上往下轻推至血液足够，迅速用血糖试纸采血头吸取血液读数，并记录数值，棉签按压小鼠尾巴止血。此过程中要注意：血糖仪及试纸型号应调整匹配；待血糖仪上显示血滴时方可吸血测值；采血量需足够且快速被血糖试纸吸入才能成功测出数值，故在此过程尽量做到一针见血，快速采血，否则既浪费了试纸，又浪费了时间，测出来的值也不精确。油红O染色法：油红作为脂肪染色剂，其染色步骤简便，染色结果肯定，并且优于苏丹Ⅳ。试剂配制：油红O0.5g异丙醇（含量98%）100ml此为油红饱和液，可长期保存备用。染色步骤：（1)冻切片（2)蒸馏水充分洗涤。（3)油红稀释液染10-15分钟，避光、密封。油红稀释液的配制：（4)取油红饱和液6毫升，加蒸馏水4毫升，静置5-10分钟后过滤后使用。（5)60%乙醇镜下分化至间质清晰。（6)水洗。（7)Marry氏苏木素复染核。（8)水洗。（9)甘油或甘油明胶封片。结果：脂肪呈鲜红色，细胞核呈蓝色，间质无色。注意事项：1.油红染色时应避免试剂挥发过多，否则易形成背景沉淀。2.60%乙醇分化，应于镜下控制至脂肪组织呈鲜红色，间质无色时为度。