实验室研究技术训练

姓名：胡明明学号：2013102040076病毒性肝炎及丙型肝炎病毒病毒性肝炎在我国，病毒性肝炎的发病数据已位于传染病的第一位，如得不到及时治疗，将发展为肝硬化以及肝癌，每年用于治疗和护理病毒性肝炎患者的费用高达3600亿人民币。病毒性肝炎对人民的健康造成了巨大危害，相应的研究工作和防疫工作显得非常重要。病毒性肝炎是由病毒感染引起的主要以肝脏炎症为表征的一类传染疾病。其主要传播途径通过肠道或体液、血液传播。病毒性肝炎主要由5类同源性不大的肝炎病毒引起：甲型肝炎病毒（HepatitisAVirus，HAV）、乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus，HBV）、丙型肝炎病毒（HepatitisCVirus，HCV）、丁型肝炎病毒（HepatitisDVirus，HDV）、戊型肝炎病毒（HepatitisEVirus，HEV）。其中又以HAV，HBV，HCV最为常见。HAV与HEV感染引起急性肝炎，HBV、HCV、HDV感染造成慢性感染并最终导致肝硬化和肝癌。除了以上5类肝炎病毒之外，诸如单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒、黄热病毒等病毒也能引发病毒性肝炎。一病毒性肝炎的历史回顾最早记录通过体液传播的肝炎病例可以追溯至1885年，一位名叫Lurman的德国人报道在不莱梅的一间1，289人的船厂中，由于针头和注射器消毒不正确的原因，15%的工人在接种天花病毒疫苗以后2-4个月纷纷出现黄疸症状，随后爆发了肝炎疫情(MocarskiandCourcelle2001)。正式对病毒性肝炎的研究开始于第二次世界大战期间。其被分为感染性肝炎（infectioushepatitis)和血清同源性肝炎（homologousserumhepatitis）(Major,Mihaliketal.1999)。后来，随着引起这两种肝炎的病毒被分别命名为HAV和HBV，甲型肝炎（HepatitisA，HA）和乙型肝炎（HepatitisB，HB）替了原有的名称。在精确的检测肝炎病毒种类的方法出现之前，病毒性肝炎病人的诊断都是通过临床和传染病学的特征来进行。1965年，HBV表面抗原（HBsAg）被发现(Blumberg,Alteretal.1965)，并在1968年发现其与HBV的联系(Reed,Xuetal.1997;Osella,Massaetal.1998)。至此，人类对病毒性肝炎有了清晰的认识。1971年，建立了以放射性免疫共沉淀的方法检测HBsAg，这种方法的准确性得到了广泛的承认(Lander,Alteretal.1971)。很快，人们又发明了HBsAg和HBV核心抗原（HBcAg）的放射免疫检测方法。通过这三种方法，感染HBV的病人都能准确的被诊断出。然而，人们发现肝脏移植并发行肝炎的病人并不被HBV感染，唯一的另一种已知病源体是HAV，而HAV的病理特征又与此不符。于是人们认为存在着至少一种其他的致肝炎的病原体。1978年，由美国国立卫生院（NIH）开展的一项工作中，被调查的30名病人中，仅2名诊断结果为HAV患者，12名为HBV患者，其他16名病人被称为非A非B型肝炎（NANBH）患者(Nelson,Marousisetal.1997)。在此基础上，NANBH的观念得到了广泛地认可，对这种未知的病原体的工作开始展开。在接下来的15年中，许许多多研究小组都声称发现了这种新的病毒，或者与其相关的病毒抗原或抗体。但事实证明没有一个报道是完全正确的。尽管如此，还是能通过这些报道窥见一些这种全新病毒的一些病毒学和流行病学的特性。第一，它除了感染人类之外还能感染黑猩猩(Alter,Purcelletal.1978;Hollinger,Gitnicketal.1978)。第二，通过它通常是通过血液传播可以预见出这种新病毒能引起慢性的感染。这样的慢性感染能导致慢性的肝脏疾病、肝硬化(Alter,Hollandetal.1975)。第三，这种病毒在脂类溶剂中没有活性，暗示这种病毒表面有包膜结构(Feinstone,Mihaliketal.1983)。第四，它能穿过50纳米的滤器，说明它的颗粒直径在50纳米以下(He,Allingetal.1987)。由此，一种细小，有包膜结构的新病毒的画面出现在人们面前。随着上世纪80年代分子生物学技术的飞速发展，使得确定这种病毒的具体信息变得可能。在慢性感染的黑猩猩身上提取得到的血浆具有高滴度的病毒(BradleyandMaynard1986)。来自Chiron公司的Houghton研究小组利用这种血浆构建了一个噬菌体表达文库(Choo,Kuoetal.1989)，在此基础上筛选与病人血清中相关的蛋白。他们得到了一个编号为”5-1-1”的克隆能表达与NANBH特异相关的抗原。5-1-1克隆的最初来源是一条约10，000个核苷酸的单链RNA分子，这个RNA分子具有一个连续的长开放阅读框。这种NANBH病毒也随后被命名为HCV(Kuo,Chooetal.1989)。丙型肝炎病毒一、丙型肝炎病毒的结构和流行病学丙型肝炎病毒（HepatitisCVirus,HCV）由于其基因组和多聚蛋白的特性与黄热病毒类似(Choo,Richmanetal.1991)，因而在病毒学分类上被归为黄病毒科（Flaviviridae）中的肝炎病毒属。早期被认为是导致非A非B型病毒性肝炎（NANBH）的致病因子，于1978年首次被发现，1989年通过基因测序技术首次获得其全基因组序列。单个HCV病毒颗粒直径在45-50纳米(He,Allingetal.1987)，最内层基因组为一条约9，500核苷酸的正意单链RNA，包裹着基因组的是由病毒核心蛋白形成的衣壳，再往外是来源自宿主的包膜结构，在这层包膜结构上插入了病毒编码的糖蛋白(Choo,Richmanetal.1991)。HCV基因组由5’末端和3’末端非翻译区域（UntranslatedRegion,UTR）和一个编码约由3，000个氨基酸的多聚蛋白的开放阅读框（ORF）组成(Choukhi,Ungetal.1998)。这个多聚蛋白在翻译的过程中和翻译后通过宿主细胞的和病毒自身的蛋白酶切割加工成特异的病毒基因产物（图1）。结构蛋白：Core，E1，E2；非结构蛋白：p7，NS2，NS3，NS4A，NS4B，NS5A，NS5B。不同的HCV毒株在基因组上表现出非常大的变异性，然而这种高变异性并非存在于HCV基因组的每个片段。相对保守的区段比如core、E1、NS5被人们研究得比较深入，并以此将HCV分为6中基因型（1-6）和50余种亚型（1a、1b、1c等）(Bukh,Milleretal.1995)。在欧美和中国主要是第1型为主、第2型以日本、中国居多、第3型在泰国、新加坡、与印度部分地区较常见、在埃及、中东与非洲中部主要是第4型，而第5型与第6型则是南非与东南亚较常见。HCV只感染人类和类人猿,据2001年的一项统计，全球已有约1.7亿人感染HCV。HCV传播途径为体液传播（parenteraltransmission），而最主要传播途径是受污染的血液。吸毒者和注射类人群（如共用针头）通常是感染HCV的高危险群，大约70%的感染者都有注射毒品的习惯。使用不干净的器械纹身和穿孔也是危险因素。随着血液筛检的进步，发展中国家现在因输血后感染HCV的风险已经大大下降。除了血液传染之外，HCV也会通过性行为与垂直传染（通过母亲传染给未出生的婴儿）来传播，在HCV感染者精液与阴道分泌物中可以发现HCV病毒颗粒的存在，目前也有一些报告已经显示性行为是可以传播HCV的。不过，经由性行为感染HCV的机率是很低的。另外HCV垂直传染的机会也很低，大约占0%到12%左右。至今为止仍有高达40%感染者是由于不明原因而感染，所以还有未知的传染途径存在。目前（2004年），针对HCV的治疗方法是持续24至48周对病人注射PEG干扰素和口服抗病毒药物利巴韦林（Ribavirin）。根据病人携带病毒亚型的不同，治愈率在50%至80%之间。但是干扰素疗法有许多副作用，尤其是对病人的心理有不良影响，病人可能产生暴躁、忧郁和恐惧等心理。影响治愈率的因素除病毒亚型外还有病人的年龄、性别、体重、病毒载量、患病时间和已经对肝脏产生的破坏程度。图1：HCV多聚蛋白在共翻译和翻译后的过程中加工形成的结构蛋白和非结构蛋白二、HCV的分子和病毒学特性（一）5’-UTRHCV完整的5’-UTR由341个核苷酸组成(Han,Shyamalaetal.1991)，其组成多个环状的二级结构(Honda,Beardetal.1999)。5‘-UTR是HCV基因组中最为保守的结构之一·(Bukh,Purcelletal.1992)，虽然基于PCR的基因分型方法发现不同基因型的HCV，其5’-UTR存在着核苷酸的多态性(Stuyver,Wyseuretal.1996)，但其整个二级结构仍然趋于保守。几个不同研究组分别证实，HCV5‘-UTR中存在着一个内部核糖体进入位点（InternalRibosomeEntrySite，IRES），这个结构能指导HCV基因组在人体内起始不需要帽子结构的翻译(Fukushi,Katayamaetal.1994;Rostoker,Pawlotskyetal.1996;Wentworth,Setteetal.1996)。随后，研究者发现IRES与HCV基因组翻译起始密码子AUG下游12-30个核苷酸能发生RNA-RNA相互作用，这种相互作用对于IRES行使功能是必要的(Honda,Brownetal.1996;Honda,Beardetal.1999)。不同基因型的HCV，其5’-UTRIRES指导翻译起始的效率也不尽相同，这是由于其核苷酸的多态性影响了RNA-RNA和RNA-蛋白质相互作用的效果(Collier,Tangetal.1998;Honda,Rijnbrandetal.1999)。5’-UTR能与宿主细胞内一些蛋白如多聚嘌呤结合蛋白（Polypyrimidinetract-bindingprotein，PTBP）和翻译起始因子eIF3相互作用，对于行使其翻译起始功能有着重要作用(AliandSiddiqui1995;Buratti,Tisminetzkyetal.1998)。然而，HCV感染后病毒的翻译起始的精确机制仍还需要进一步的研究来阐明。（二）3’-UTR编码约3,000个氨基酸的ORF的终止密码子之后便是HCV的3’-UTR。3’-UTR由一个约30个碱基的可变区和98个碱基的保守区组成(Kolykhalov,Feinstoneetal.1996;Taylor,Shietal.1999)。通过计算机的结构预测，其能形成稳定的柄环状二级结构(BlightandRice1997;ItoandLai1997)。3’-UTR中位于3’末端的98个保守核苷酸能与宿主细胞内PTBP蛋白发生特异的相互作用(ItoandLai1997)，暗示着其在病毒的复制及翻译过程中起着调控作用(ItoandLai1999)。利用缺失性感染克隆在黑猩猩上的实验表明，3’-UTR的98个保守核苷酸对于病毒的感染能力有着重要的作用，然而其5’端30个可变碱基则显得不重要(Kolykhalov,Mihaliketal.2000)。（三）核心蛋白CoreHCV多聚蛋白的N端头191个氨基酸被认为是其核心蛋白core。Core蛋白分子量在21-23kDa，形成覆盖在HCV基因组外的核衣壳(Hijikata,Katoetal.1991)。整个Core蛋白的编码区域都属于高度保守区段，其分子量的可变性通过SDS-PAGE分析得知是其C末端的缩短产物(Hijikata,Katoetal.1991;Scheuer,Ashrafzadehetal.1992)。Core蛋白的基本功能特性被认为是其N端具有核定为信号和DNA结合基序(Chang,Yenetal.1994)。然而没有一项临床数据表明感染HCV的肝细胞核内检测出core蛋白(