得克隆的提取方法

附录1得克隆的提取方法步骤生物体处理底泥处理水样处理具体操作具体操作具体操作一，研磨研磨瓶中研磨后，称5g装入烧杯。称10g底泥装入烧杯中1．将分液漏斗，阀门，瓶塞用丙酮冲洗干净吹干后固定在铁架台上，2.加入纯水观察是否漏水3.将1000ml水样通过三角漏斗倒入分液漏斗中，每次加完后分液漏斗都需用丙酮冲洗，水样瓶中在加入100ml二氯甲烷冲洗后倒入分液漏斗中，4.每个分液漏斗中用枪加入100μl代标5.用力摇晃分液漏斗3-4min，定时拧开阀门放气，6.摇晃后将漏斗放在铁架台上拧开瓶塞，等液面分层，7.为每个分液漏斗准备250ml平底烧瓶，三角漏斗，漏斗里放置脱脂棉，无水硫酸钠，8.液面分层后打开阀门让液体流入三角漏斗至分层处关闭阀门，9.用少量正己烷冲洗三角漏斗，10.分液漏斗中加入50ml二氯甲烷，后摇晃3-4min，放置铁架台静置到分层，打开阀门让液体流入三角漏斗至分层处关闭阀门，11.重复步骤9和10.后用正己烷冲洗三角漏斗三次，带样品流经扣将平底烧瓶盖上瓶塞。二，去水BLK,SPK瓶为空同生物体烧杯中加入无水硫酸钠搅拌均匀三，萃取（需测含水率）平底烧瓶中加入200ml混合液同生物体将去水样品加入纸盒中，放入索式，索式中加入混合液至纸盒外沿下，烧杯中的残余样品用混合液冲洗后倒入索式索式盖上铝箔静置30min烧杯中加入沸石所有样品均加入代标各100μl，SPK中单独加入PCB&OCPSPKstd100μl标样用后缠生胶带放入冰柜中冷冻将索式放在水浴锅60℃萃取24h后冷却至室温，循环水关闭将索式内剩余液体倒入烧杯中（若液体偏少，也可用丙酮冲洗索式内壁残液）将瓶中沸石取出，盖上瓶塞四，旋蒸（置换出丙酮/二氯甲烷混合液）事先将旋蒸仪调至2℃，水温能加热至28℃同生物体1．旋蒸至1ml2．加入10ml正己烷，3．旋蒸至1ml旋蒸至1ml加入10ml（或20ml）正己烷，继续旋蒸至1ml再加入10ml（或20ml）正己烷，继续旋蒸至1ml五，去水标记250ml平底烧瓶后加入三角漏斗，漏斗里放入棉花，无水硫酸钠同生物体无将旋蒸后的样品直接倒在三角漏斗里，用正己烷反复冲洗烧瓶3遍（标记部分应始终朝上）及无水硫酸钠，待无液体流入烧瓶，轻磕漏斗下部使剩余液体进入盖紧瓶塞六，旋蒸样品旋蒸至1ml同生物体无七，定容将样品移入定容管中，正己烷定容到10ml无无八，留样将试管在混匀机上混匀无（若留同生物体）无（若留同生物体）取5ml移至标记好的留样瓶中，留样瓶用生胶带缠好九，测脂肪含量给每个样品备一个小烧杯，上面盖铝箔，钻2-3个小孔无无烧杯在天平上称重在剩余的5ml试管中搅匀（若不留样则为10ml）用1ml枪头移取1ml样品至烧杯中，并立即称重烧杯放纸箱中每三天称重一次，称3次十，磺化支好250ml分液漏斗（阀门/瓶塞）同生物体无（若水质不好可进行此操作）分液漏斗中加入纯水后静置10min看是否漏水将水排空将第八步剩余样品（4ml或9ml）直接倒入分液漏斗中，用正己烷冲洗至20ml左右量取5ml浓硫酸倒入分液漏斗中充分混匀（过程中需要开盖放弃），后加盖塞子（塞子用纯水冲洗），静置分液漏斗5-12h，直到液面出现分层，打开阀门使下部液体流入废液缸（此过程重复3次）量取25ml纯水加入分液漏斗充分混匀，静置，待分层后将下部液体流入废液缸（此过程重复5次）支好平底烧杯+三角漏斗（漏斗里放入棉花，无水硫酸钠）打开分液漏斗阀门将剩余液体流入三角漏斗中，用正己烷反复冲洗三遍，待漏斗下部不再有液体流出后，轻磕其下部，使剩余液体流入三角瓶中，盖紧瓶塞十一、旋蒸样品旋蒸至1mL同生物体无十二，过柱将柱子、活塞安装好同生物体同生物体柱子底部加棉花，用玻璃棒压实加无水硫酸钠1cm左右加正己烷5ml，边加边用橡皮棒敲打柱子赶走气泡用小烧杯称取5.5~5.7g硅胶，加入正己烷用药匙搅匀将烧杯中的硅胶倒入柱子中，残留硅胶用正己烷冲净在柱子下放置废液瓶，打开活塞阀门接废液。当柱液面降到浑浊层5cm处即可。同时用正己烷冲洗内壁。加入无水硫酸钠1cm待液面降到表层时加入5ml混合液（HEX:DCM=1:1）冲洗柱子待液面降至无水硫酸钠顶部时关闭阀门用250ml平底烧瓶更换废液瓶用移液管将旋蒸后的液体移到柱内，加入三次1ml混合液用于冲洗残液，同时打开阀门留液待液面降至无水硫酸钠顶部时加入50ml混合液进行淋洗，阀门流速不要过快待液面降至无水硫酸钠顶部时全部打开阀门，待流干后即可取下柱子，底部敲打洗瓶口是残液流入洗瓶口使残液流入洗瓶中十三，旋蒸样品旋蒸至1ml同生物体同生物体十四，氮吹旋蒸后液体用吸管转移至浓缩瓶中，残留用正己烷1ml洗三次同生物体同生物体将1000ul枪头套在氮吹仪上（隔一套一），共六个将浓缩瓶夹在氮吹仪底部弹簧上，枪头不要接触浓缩瓶中液面打开氮气罐阀门（开一半）调节氮吹仪气杆上的阀门至适度待吹至0.2~0.3ml时加入异辛烷1.5~2.0ml加入内标100μl在振荡器上搅匀继续氮吹至1ml用吸管移至色谱瓶中色谱平用胶带缠好放入冷柜1.、测含水率须在烘箱中至少7个小时。2、代标需提前半个小时从冰箱拿出。3、提前一天配置混合液（丙酮：二氯甲烷=1：1）。3、每个索氏配一把镊子用丙酮冲洗好。4、硅胶需提前在烘箱中烘干7小时，后按3.3%含水率加水，96.7g硅胶，3.3g水。5、若过柱时硅胶不加水灭活，则需加入10g，若加水激活只需5.5g。