教师现实表现材料

中国组织工程研究第20卷第32期2016–08–05出版ChineseJournalofTissueEngineeringResearchAugust5,2016Vol.20,No.32ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH4745·研究原著·李英，男，1982年生，河南省开封市人，主治医师，主要从事儿科方向研究。中图分类号:R394.2文献标识码:A文章编号:2095-4344(2016)32-04745-06稿件接受：2016-05-30小儿骨髓间质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞李英，高杰，商亚敏，汪奇伟，王海磊(河南大学淮河医院儿科，河南省开封市475000)引用本文：李英，高杰，商亚敏，汪奇伟，王海磊.小儿骨髓间质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞[J].中国组织工程研究，2016，20(32):4745-4750.DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.32.005ORCID:0000-0003-4014-1855(李英)文章快速阅读：文题释义：骨髓间质干细胞诱导分化：在适当的诱导条件下，骨髓间质干细胞可分化为间充质以外细胞，该类细胞的定向性、谱系限定性及细胞分化终点从内在的基因组调节机制上来讲是多方向的，环境中的信息可诱导这类细胞表现出超越其经典分化方向的多方向分化潜能性。微管蛋白：是球形分子，有两种类型：α微管蛋白(α-tubulin)和β微管蛋白(β-tubulin)，这两种微管蛋白具有相似的三维结构，能够紧密地结合成二聚体，作为微管组装的亚基。β微管蛋白Ⅲ是微管蛋白tubulin家族的一种微管成分，是原始神经上皮中重要的神经元标志物。摘要背景：以往相关报道大多为成人或者动物骨髓间质干细胞，关于儿童骨髓间质干细胞体外培养及定向分化的研究相对较少。目的：探讨儿童骨髓间质干细胞诱导分化为神经干细胞及神经元细胞的能力。方法：取传12代儿童骨髓间质干细胞，加入预诱导液(含体积分数为10%胎牛血清及1mmol/Lβ-巯基乙醇的DMEM培养液)、诱导液(含2%二甲基亚砜及150μmol/L丁基羟基茴香醚的DMEM培养液)进行定向诱导分化。诱导后30min，7d，免疫细胞化学检测神经干细胞特异性抗原nestin、神经丝蛋白β-tublinⅢ的表达，诱导后0，5.5，6d，RT-PCR检测nestinmRNA的表达。结果与结论：①经二甲基亚砜、丁基羟基茴香醚联合诱导之后，细胞胞体逐渐收缩为锥形和多角形、类圆形，胞体伸出突起并逐渐延长为细丝状。联合诱导至第6天，相邻细胞突起发生交互，形成网状；②诱导30min后，nestin抗原表达呈阳性，诱导7d后，β-tublinⅢ表达呈阳性；③诱导开始时(0h)未出现nestinmRNA表达，诱导5.5h时nestinmRNA表达呈阳性，诱导6d时不再表达；④结果表明，小儿骨髓间质干细胞经二甲基亚砜、丁基羟基茴香醚体外联合诱导可分化为神经干细胞与神经元细胞。关键词：干细胞；骨髓干细胞；儿童；骨髓间质干细胞；体外培养；细胞诱导；细胞分化；神经干细胞主题词：儿童；骨髓；间质干细胞；细胞分化；神经干细胞；组织工程小儿骨髓间质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞儿童骨髓间质干细胞分离培养预诱导液(含体积分数为20%胎牛血清及1mmol/Lβ-巯基乙醇的DMEM培养液)培养24h，吸出预诱导液，加入诱导液(含2%二甲基亚砜及150μmol/L丁基羟基茴香醚的DMEM培养液)培养体外联合诱导分化体外联合诱导30min后，nestin抗原表达呈阳性，联合诱导7d后，β-tublinⅢ表达呈阳性，说明能够分化为神经干细胞以及神经元细胞李英，等.小儿骨髓间质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞P.O.Box10002,Shenyang110180(DepartmentofPediatrics,HuaiheHospitalofHenanUniversity,Kaifeng475000,HenanProvince,China)AbstractBACKGROUND:Inthepast,thecultureanddifferentiationofbonemarrowmesenchymalstemcellsinvitroweremostlyreportedintheadultoranimalratherthaninchildren.OBJECTIVE:Toexploretheabilityofbonemarrowmesenchymalstemcellsfromchildrendifferentiatingintoneuralstemcellsandnervecells.METHODS:Bonemarrowmesenchymalstemcellsfromchildrenwereisolatedandcultured,andpassage12cellswereculturedinthepre-inductionmedium(DMEMculturemediumcontaining10%fetalbovineserumand1mmol/Lβ-mercaptoethanol)andinductionmedium(DMEMcontaining2%dimethylsulfoxideand150μmol/Lbutylatedhydroxyanisole).Expressionofnestinandβ-tublinIIIwasdetectedusingimmunocytochemistrymethodat30minutesand7daysafterinduction,whileRT-PCRwasusedtodetectnestinmRNAexpressionat0,5.5,6daysafterinduction.RESULTSANDCONCLUSION:Aftercombinedinduction,thecellsshrankfromroundshapetotapered,polygonalorovalshape,andcellprocessesextendedgraduallyandbecamefilament-likeshape.Interconnectedcellsformedanetworkat6daysaftercombinedinduction.Theexpressionofnestinantigenwaspositiveat30minutesafterinduction,whiletheexpressionofβ-tublinwaspositiveat7days.RT-PCRfindingsshowedthatpositiveexpressionofnestinmRNAwasdetectedat5.5hoursofinduction,andthendisappearedat6days.Thesefindingsshowthatthecombineduseofdimethylsulfoxideandbutylatedhydroxyanisolecaninducebonemarrowmesenchymalstemcellsfromchildrentodifferentiateintoneuralstemcellsandnervecellsinvitro.Subjectheadings:Child;BoneMarrow;MesenchymalStemCells;CellDifferentiation;NeuralStemCells;TissueEngineeringCitethisarticle:LiY,GaoJ,ShangYM,WangQW,WangHL.Neuron-likedifferentiationofbonemarrowmesenchymalstemcellsfromchildreninvitro.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiu.2016;20(32):4745-4750.0引言Introduction干细胞能发育成几乎任何类型的细胞，替换原来受损的细胞，能够用来修复受损组织，例如修复多发性硬化症或脊髓损伤等疾病造成的伤害[1]。骨髓来源间质干细胞是一种重要的干细胞类型，具有很强的多向分化能力[2]。在一定条件下，骨髓间质干细胞能够分化为神经细胞，并应用于治疗多种神经系统疾病。不同年龄的骨髓间质干细胞体外增殖、分化特点有很大差异。以往有学者通过研究发现[3]，人骨髓间质干细胞在全骨髓中的比例大约为1∶10000，随着个体年龄的增加逐渐减少。以往研究大多为成年人骨髓间质干细胞的体外培养分化相关研究[4]，关于儿童骨髓间质干细胞体外培养及定向分化的研究相对较少。实验在体外培养儿童骨髓间质干细胞，并进行神经向诱导分化，为骨髓间质干细胞治疗神经系统疾病提供理论依据。1材料和方法Materialsandmethods1.1设计体外观察性实验。1.2时间及地点实验于2015年9至12月在河南大学淮河医院实验室完成。1.3材料5例外伤手术儿童骨髓，男2例，女3例，年龄5-12岁，中位年龄8.1岁，均为河南大学淮河医院标本室提供，患儿家长均知情，并签署同意书。研究相关方案均提交河南大学淮河医院医学伦理部门审核，符合相关伦理学要求。1.4实验方法1.4.1人骨髓间质干细胞分离培养[5]取5mL骨髓标本与肝素进行混合，添加等量PBS混匀，加入等量Percoll分离液，离心30min，收集中间单个核细胞层，再次离心后去掉上清液，添加含胎牛血清的低糖DMEM培养液接种在培养皿中，置于37℃二氧化碳培养箱中进行培养，每日置于倒置显微镜下观察细胞生长情况，待细胞融合达到80%以上进行传代培养。1.4.2人骨髓间质干细胞表面标记物测定[6]取生长状态良好的第3代人骨髓间质干细胞，待细胞接近80%融合时，加入胰蛋白酶消化，获得单细胞悬液。取1×106细胞利用流式细胞仪检测细胞表型。李英，等.小儿骨髓间质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH4747孔板中，每孔1mL，每3d换液1次，每天取3孔进行细胞计数，连续观察8d，以培养时间为横轴，细胞数为纵轴，描绘细胞生长曲线。1.4.4联合诱导分化[7]将传12代的人骨髓间质干细胞接种于含体积分数为10%胎牛血清、10μg/L碱性成纤维细胞生长因子的DMEM培养液，培养24h，吸出培养液，加入预诱导液(含体积分数为20%胎牛血清及1mmol/Lβ-巯基乙醇的DMEM培养液)，培养24h，吸出预诱导液，最后加入诱导液(含2%二甲基亚砜及150μmol/L丁基羟基茴香醚的DMEM培养液)，在倒置相差显微镜下观察细胞形态。1.4.5免疫细胞化学检测联合诱导后30min，7d，取生长有细胞的盖玻片，用40g/L多聚甲醛固定，进行小儿骨髓间质干细胞体外诱导分化为神经元细胞实验所用主要试剂与仪器：试剂及仪器来源肝素枣庄赛诺康生化股份有限公司Percoll分离液美国Pharmacia公司低糖DMEM美国Hyclone公司胎牛血清潍坊瑞华生物科技有限公司胰蛋白酶上海江林生物科技有限公司碱性成纤维细胞生长因子以色列