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化工进展·392·CHEMICALINDUSTRYANDENGINEERINGPROGRESS2012年第31卷第2期进展与述评微生物发酵法生产紫杉醇的研究进展张昕欣1,吴翰桂1,奚立民1,王玲萍2(1台州职业技术学院生物与化学工程系,浙江台州318000;2浙江海正药业股份有限公司,浙江台州318000)摘要:微生物发酵生产紫杉醇由于其环境友好、工艺简单、成本低廉的优势,近年来被认为是解决紫杉醇生产原料来源危机的良好方法。由于单位发酵液中紫杉醇产量太低,迄今为止尚没有一株可以进行工业化生产的产紫杉醇菌株问世。本文就微生物发酵法生产紫杉醇的研究现状进行了总结分析,主要包括紫杉醇产生菌的筛选、发酵培养基的优化、微生物体内紫杉醇合成相关酶基因的克隆及产紫杉醇菌种的改良。关键词:紫杉醇产生菌;培养基优化;菌种改良中图分类号:Q939.79文献标志码:A文章编号:1000–6613(2012)02–0392–05RecentresearchandprospectonmicrobialproducingtaxolZHANGXinxin1,WUHangui1,XILimin1,WANGLingping2(1DepartementofBiologicalandChemicalEngineering,TaizhouTechnicalCollege,Taizhou318000,Zhejiang,China;2HisunPharmaceuticalCo.Ltd.,Taizhou318000,Zhejiang,China)Abstract:Foritsenvironmentallyacceptable,relativelysimpleandinexpensivefeatures,microor-ganismsfermentationhasbeeninvestigatedasapotentialalternativestosolvethecrisisofrawmaterial.Nocommercialfermentationstrainhasbeenusedsofar,becauseofthelowproduction.Theaimofthisstudyistoreviewandanalysisthepresentstatusofresearchonpaclitaxel-producingbymicroorganisms,screeningofpaclitaxel-producingmicroorganisms,optimizationoftheculturemedium,genesofthepaclitaxelbiosynthesisandimprovementofthetaxol-producingmicroorganisms.Keywords:taxol-producingmicroorganisms;optimizationoftheculturemedium;improvementofstrain紫杉醇(taxol)是在20世纪60年代早期从太平洋紫杉中分离出来的一种二萜类生物碱(图1),经研究发现其具有广泛的抗癌活性[1]。自1993年第一株产紫杉醇真菌被发现并报道后[1],微生物发酵法生产紫杉醇逐渐被认为是一种环境友好、成本低获得能够适用于发酵生产的工业菌株是实现发酵生产紫杉醇的前提,但是目前已知的微生物生产紫杉醇产量很低,不能够满足产业化生产要求(产率高于1mg/L)[4],需要进行一系列的优化改良。主要通过以下两个途径来解决:一是从自然界中继续寻找更适合发酵的原始菌株;二是对现有的菌株进行遗传改造,提高其发酵紫杉醇产率。目前报道的产紫杉醇菌株主要是红豆杉内生菌[5],人工培养时菌体往往生长缓慢,从而影响其最终紫杉醇的产量;因此新菌株的筛选与现有菌株的遗传改造都需廉的解决紫杉醇生产原料来源危机的方法[2-3]。收稿日期:2011-08-03;修改稿日期:2011-09-16。基金项目:台州市科技计划项目(092KY01)。第一作者及联系人:张昕欣(1980—),女,讲师,主要从事微生物药物方面的研究。E-mailzhangxinxinshx@126.com。图1紫杉醇的化学结构第2期张昕欣等:微生物发酵法生产紫杉醇的研究进展·393·要进行更深入的研究。因的部分编码序列被报道用做探针,检测菌株是否具有合成紫杉醇的潜力[13-15]。Zhou[12]2007年报道,分别以待检的38株菌株的基因组序列为模板,利用ts基因特异性引物作PCR。经后续检测,PCR结果为阳性的12株菌株中,有3株为明显产紫杉醇的菌1紫杉醇产生菌的鉴定筛选自从短叶红豆杉(Taxusbrevifolia)中分离到第一株产紫杉醇的内生真菌Taxomycesandreanae后[6-7],至2010年,已有近百株产紫杉醇的菌种被分离鉴定出来,其中,超过80%为真菌,其余为细菌和放线菌[5]。据报道,除一株异角状拟盘多毛孢(Pestalotiaheterocornis)采自红豆杉树林的泥土中外[8],其余菌株皆为采自红豆杉及其相近种属的植物内生菌。经鉴定,这些已报道的产紫杉醇内生真菌大都属于真菌中的子囊菌纲和半知菌纲[5]。在产紫杉醇菌种筛选过程中,除传统的分离菌种,利用色谱、质谱、核磁共振等方法鉴定菌种产物结构的工作外,还有酶联免疫法及分子探针法两种高通量的筛选方法被引入了紫杉醇产生菌的初筛鉴定中。[13-15]的研究结果也株。Miao、Kumaran、Zhang等[14]利用dbat部证实了这种方法的可行性。Miao等分序列作探针,确定了其课题组从中国红豆杉中获得的几十株内生真菌中的4株具有合成紫杉醇的能[13]力。2009年,Kumaran等利用TS的基因中的保守区部分序列作探针,对3株高产紫杉醇真菌进行检测,结果全部都呈阳性。该结果进一步证实了利用ts的部分序列作探针,进行紫杉醇产生菌筛选的[15]可行性。Zhang等利用BAPT和DBAT的部分编码序列作探针,从近百株植物内生菌中筛选得到了3株产紫杉醇的菌株。Zhang称,dbat、bapt作为探针所获的菌株初筛结果将更为准确可靠。由于此种方法是对待筛菌株的紫杉醇合成途径中相关酶类的基因进行检测,得到的结果只能作为菌株是否能够产生紫杉醇的依据;因此更适用于原始采集株的初筛,不适用于产紫杉醇菌株诱变后高产量菌株的筛选。1.1酶联免疫吸附法20世纪90年代已有抗紫杉醇抗体被纯化制备的报道[9],现今商业化的紫杉醇免疫试剂盒已在出售。2000年,Caruso[10]利用此方法从221株原始采集株中获得了15株产紫杉醇真菌、10株产紫杉醇放线菌。经后续鉴定检测,这些菌株发酵液中紫杉醇的含量在10~100ng/L不等,可见这种利用含有抗紫杉醇抗体的酶联免疫试剂盒来检测不同采集菌种的液体培养基中紫杉醇的含量,以此来对原始采集株进行初筛的方法具有较高的准确度和灵敏度。此外,在树状多节孢(Nodulisporiumsylviforme)原生质体诱变实验中发现:随着突变株对制霉菌素抗性的提高,其紫杉醇产量也随着相应地提高,但其机理并不清楚[16]。因此推测,若已知某产紫杉醇菌种体内某些抗生素抗性基因与紫杉醇合成某一相关基因存在相互的调控影响,则该特性可被用于产紫杉醇菌株诱变后高产量菌株的初筛。Li等[11]也有类似报道,利用特定的抗紫杉醇抗体,对落羽杉(Taxodiumdistichum)中分离得到的内生菌培养物进行检测,筛选得到了紫杉醇产生菌。鉴于其对菌株培养物中紫杉醇的含量具有较高的灵敏度,酶联免疫吸附法既可用于原始采集株的初筛,也可以用于产紫杉醇菌株诱变后高产量菌株的筛选。2产紫杉醇微生物的发酵培养基优化目前关于真菌产紫杉醇发酵条件的研究报道不是很多。可以肯定的是,由于植物内生真菌脱离其宿主体后次生代谢会停止或延缓,因此在产紫杉醇内生真菌的发酵液中加入红豆杉针叶提取物,可以提高紫杉醇的产量[4]。另外,培养基中其它一些影响紫杉醇代谢途径的物质的加入也会影响紫杉醇的最终产量。1.2关键酶基因部分序列作分子探针迄今已有紫杉二烯合成酶(taxadienesynthase,TS;其相应的编码基因ts)、3-氨基-3-苯基丙酰转移酶(C-13phenylpropanoylsidechain-CoAacyltransferase,BAPT;其相应的编码基因bapt)、脱乙酰巴卡亭Ⅲ-10β-O乙酰转移酶(10-deacetylbaccatinIII-10-O-acetyltransferase,DBAT;其相应的编码基因dbat)3种紫杉醇合成途径中的关键酶基2.1代谢途径的诱导物提供紫杉醇代谢途径的诱导物可以帮助启动紫杉醇的合成,提高其产量。例如,在小孢拟盘多毛孢(Pestalotiopsismicrospora)发酵液中加入·394·化工进展2012年第31卷适当的Mn2+、Mg2+、Zn2+离子有助于紫杉醇的积累[17]。但是在不同菌株不同发酵条件的情况下,由于大多产紫杉醇菌株为植物内生菌,因此某些植物生长调节剂会对其产紫杉醇有一定的调节作用。例如,植物光合作用促进剂氯化氯胆碱(Chlorocholinechloride,CCC)对于内生真菌产紫杉醇有抑制作用;而促进花芽形成的N-二甲氨基琥珀酸(N-dimethylaminosuccinicacid)对其有提高产微生物生理代谢所需营养物质会有很大不同,而且紫杉醇的代谢途径会有所差异,所以这些添加物的成分很难确定,具有针对性的研究还有待于深入进行。量的作用[6,20]。2.2代谢合成的前体研究产紫杉醇内生真菌的代谢机理和紫杉醇的合成机制,进而找到其代谢合成的前体,并且将这些前体有目的地加入紫杉醇发酵液中,能够进一3微生物体内紫杉醇代谢途径相关基因的克隆与应用步提高其产量。根据Eisenreich等[18]的研究,紫杉紫杉醇的生物合成大约要经过19个酶促反应醇分子的双萜类母核合成所用的异戊二烯是由葡萄糖的初级代谢产物磷酸丙糖与丙酮酸脱羧产物二碳单位缩合进而分子内重排后产生的。因此,产紫杉步骤[21-23]。合成起始物为一种常见的二萜前体牛儿基牦牛儿基焦磷酸(geranylgeranyldiphosphate,GGPP),GGPP经TS催化环化生成紫杉二烯醇菌的发酵过程中应尽量地使用以葡萄糖为碳源的[taxa-4(5),11(12)-diene][22-23]。紫杉二烯经官能化反培养基。Fleming等[19]证实紫杉醇的C13侧链是由苯应后生成10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ(10-deacetyl-baccatinIII),进而经过酰化酯化反应丙氨酸C2位羟基化和氮原子的酰基化作用而形成,故在发酵过程中,应考虑添加苯丙氨酸提高紫杉醇的含量。生成紫杉醇(图1)[24-25]。这些结论主要来自于对2.3竞争性代谢途径抑制剂植物体内紫杉醇合成途径的研究,微生物相关的代谢研究则较少。目前已报道从产紫杉醇微生物体内克隆得到的紫杉醇代谢途径相关基因序列除紫杉二烯合成酶的编码基因ts外,还有参与催化紫杉二烯生成10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ的3-氨基-3-苯基丙酰转移酶基因bapt以及参与催化巴卡亭Ⅲ生成紫杉醇的脱乙酰巴卡亭Ⅲ-10-O乙酰转移酶基因dbat,具体Li等[20]在研究小孢拟盘多毛孢发酵生产紫杉醇时发现,麦角固醇的合成会竞争紫杉醇合成的前体,进而证实小孢拟盘多毛孢发酵液中如果有甾醇类物质合成途径的抑制剂的加入,会提高紫杉醇的积累量。其中,以戊唑醇和三唑酮的效果最为明显,分别可以将紫杉醇的积累量提高50倍和25倍,但由于二者在发酵液中的存在会影响小孢拟盘多毛孢菌丝体的生长,所以在发酵开始8~10天后加入效果最佳。由此可见,寻找产紫杉醇菌株体内与紫杉醇合成存在竞争关系的物质合成途径,并对其加以抑制,则可以显著提高紫杉醇的发酵产率。情况如表1所示[12-14,26-29]。4改良产紫杉醇菌种的方法与应用通过利用各种生物工程技术,对产生紫杉醇的菌株进行遗传改造,进而构建高产紫杉醇内生真菌表1微
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