微生物学研究与应用技术

Module1：微生物学研究与应用技术一、PCR技术1、PCR原理：PCR技术是以DNA双链的复制和变性、复性为原理，在人工调控的温度下，提供DNA复制所需的引物、模板、dNTPs、聚合酶等条件，从而使得DNA可周而复始的进行复制扩增。2、PCR循环（步骤）：变性（denaturation）—退火（annealing）—延伸（extension）；变性：高温下，模板DNA发生热变性，双链解开成两条单链；退火：反应体系降温，使引物与模板DNA两端的碱基配对；延伸：DNA聚合酶使引物3’端向前延伸合成新链；新合成的单链又可作为下一轮循环的模板进行复制，并不断重复上述的3个步骤，使得DNA片段呈指数增长，在1h内可重复25~30次，DNA的扩增量可达106~107倍。3、PCR常用的耐热聚合酶：（1）TaqDNA聚合酶，耐高温但缺乏校正功能，使用最为广泛；（2）PfuDNA聚合酶、VentDNA聚合酶，既耐高温又具有校正功能的聚合酶；（3）TthDNA聚合酶，具有逆转录活性的聚合酶，可使RT-PCR在同一体系中进行，即使仅有极少量的RNA也可被扩增，可用于研究细胞RNA和RNA病毒。4、PCR的应用：（1）可用于基因的扩增和制备DNA探针，如已知目的基因两端的序列，利用PCR便可将其扩增出来，也可用于定位诱变和DNA测序；（2）可用于临床医学上检测传染病、诊断遗传病和分析癌基因；（3）在法医上可用于进行亲子鉴定、个体鉴定等。5、PCR定位诱变技术（最常用）：任何基因只需要知道两端及需要的变异部位的序列即可进行PCR定位诱变。PCR诱变有两种方法：（1）基因末端诱变：5‘端或3‘端引物含有变异碱基，便可使PCR产物的末端引入变异。（2）基因中部诱变：在需要诱变的位置合成一对含有变异碱基的互补引物，然后分别于5’端引物和3’端引物进行PCR，这样便可得到两个含变异碱基的PCR产物，由于二者中间有一段序列彼此互补重叠，在重叠部位经重组PCR就能得到变异的PCR产物。图P273二、革兰氏染色法基本原理方法：通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞膜内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物（CVI）。革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚，肽聚糖网层次多和交联紧密，故遇乙醇处理时不会溶出缝隙，因此能把结晶紫与碘的复合物牢牢地留在壁内，是其保持紫色。反之，革兰氏阴性菌因为细胞壁薄，外膜层的脂类含量高、肽聚糖层薄和交联度差，所以在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能截留结晶紫-碘复合物的溶出，因此，通过乙醇脱色后细胞退为无色。这时再经过沙黄等红色染料进行复染，只有革兰氏阴性菌会被染成红色。三、常用基因工程载体1、克隆载体：是指负责将外源基因运送到宿主细胞内进行复制与扩增的运输工具。2、作为克隆载体的要求：（1）载体应为一个独立的复制子，含有复制起始点且可在细胞内自主复制；（2）含有多克隆位点，即含有若干限制酶单一切点，以便插入外源基因；（3）含有选择标记，便于对阳性克隆的筛选和鉴定；（4）具有一定的安全性，在胞内不发生重组和转移，在胞外也不能自由扩散。3、基因工程常用的5大载体：质粒载体、ƛ噬菌体载体与黏粒载体、M13噬菌体载体与噬菌粒载体、真核生物克隆载体、人工染色体。4、主要克隆载体及其主要用途：一、细菌质粒载体—外源基因的克隆与表达，15kb；二、噬菌体载体—构建基因文库及cDNA文库，23kb；三、黏粒载体（柯斯质粒载体）—构建基因文库，49kb；四、M13噬菌体载体—单链DNA制备和测序、定位诱变、噬菌体展示，300~400bp；五、噬菌粒载体—外源基因的克隆与表达，10kb；六、酵母质粒载体—真核基因的克隆与表达，15kb；七、Ti质粒载体—植物基因工程载体，20kb；八、酵母人工染色体（YAC）—大基因簇相关功能基因研究、实现人类基因组计划和人类疾病相关基因研究、构建真核生物大片段基因文库，100~2000kb；九、细菌人工染色体（BAC）—同上，120~300kb；5、载体对表达宿主的基本要求：（1）能够高效吸收外源DNA；（2）不具有限制修饰系统，不降解导入的未经修饰的外源DNA；（3）不具有DNA重组系统，常用重组缺陷型（recA-）菌株；（4）根据载体类型选择相应宿主：如用ƛ噬菌体或黏粒作为载体，须选择ƛ噬菌体敏感的宿主（E.coli-K12）；选用M13时，则应选择含有F因子的雄性大肠杆菌为宿主；（5）根据载体的标记选择合适的宿主，例如载体携带氨苄青霉素抗性基因作为选择标记，则应选择氨苄青霉素敏感菌株为宿主；（6）具有安全性，宿主细胞应该对人、畜、农作物无害。6、各种常见载体的特点特性：（1）质粒载体：含有复制起点；含有多种限制酶的单一识别位点；含有抗生素抗性基因的选择标记；高拷贝，每个细胞含有10~200个拷贝的松弛型质粒；具有较小的相对分子质量，易于DNA的分离和操作；可通过转化或电穿孔法极易导入宿主细胞。（2）ƛ噬菌体载体：由两种类型，插入型（只含有一个单一限制位点，用于插入外源基因）和取代型（具有成对的限制酶切位点，外源基因可取代限制位点之间的DNA）；优点有：可克隆大约23kb的外源基因，克隆能力大于质粒；感染宿主效率高达100%；不足之处在于，插入的外源基因的长度有限（需控制在野生型ƛDNA片段的78~105%），因为噬菌体头部可容纳的DNA量有限。（3）黏粒载体：由ƛ噬菌体的COS位点和质粒DNA共同构建的；特点：克隆能力远超过质粒和噬菌体（本身5~7kb，克隆35~48kb）；在宿主细胞内以质粒形式进行复制；由于可以搭载更大的DNA片段，所以可用于构建基因文库。（4）M13噬菌体载体：M13是大肠杆菌的丝状噬菌体，其基因组中除了基因间隔区（GI）外，其他均为复制和装配所需要的基因；所以其特点是：后期筛选阳性克隆便利（1、在IG中插入一段可以编码β-半乳糖苷酶的α肽基因，使其可与LacZ基因突变缺陷型的大肠杆菌互补生成具有活性的β-半乳糖苷酶。然后将M13和大肠杆菌涂布在含有IPTG和呈色物质X-gal的平板上，就会形成蓝色噬菌斑；2、如果在α肽编码区内插入限制酶切位点，当外源基因插入时，便会破坏α肽的互补作用，从而重组噬菌体就会形成白色噬菌斑。）；由于M13一般只能克隆300~400bp的片段，所以常用于制备测序用的单链DNA、单链DNA探针和定位诱变模板，也可用于噬菌体展示（phagedisplay：将编码多肽的外源DNA片段与噬菌体表面蛋白的编码基因融合后，以融合蛋白的形式呈现在噬菌体的表面，被展示的多肽或蛋白可保持相对的空间结构和生物活性，展示在噬菌体的表面）。（5）噬菌粒载体：由M13的基因间隔区（含复制起始位点）和质粒DNA共同构建的载体。其优点是：1、载体本身分子小（约3kb），易于遗传操作；2、可克隆10kb的外源基因片段，克隆能力高于M13；3、可用于制备单链或双链DNA。（真核生物克隆载体）（6）酵母质粒载体：多为为穿梭载体，可在酵母细胞中复制也可在细菌中复制；主要有3种类型：1、附加体质粒（可在酵母中复制，高拷贝）2、复制质粒（可在酵母中复制，中等拷贝）3、整合质粒（能整合到酵母染色体，不能自主复制，但可在细菌中自主复制）。（7）Ti质粒载体：为植物基因工程中的理想载体。（8）病毒载体：1、哺乳动物病毒载体（高效识别宿主并将基因整合到宿主细胞中；高拷贝，强启动子）；2、昆虫动物病毒（优点：可克隆片段长可达100kb；高表达；安全性高）；3、植物病毒载体（植物基因工程载体）。（人工染色体）—大批量携带DNA的载体（9）酵母人工染色体（YAC）：一类目前能够携带最大量外源基因的载体；结构上有三个必备元件：着丝粒、端粒、自主复制序列（一般染色体所必需的）；本身只有10kb，但能携带100~2000kb外源DNA片段。因此既保证所插入的外源基因片段结构完整，有可大大减小基因库所要求的克隆数。（10）细菌人工染色体（BAC）：可携带120~300kb外源片段；特点：通常仅保留F因子的紧密型控制的复制子，同时还含有多克隆位点和遗传标记；电穿孔法即可将其倒入宿主细菌中；不易发生重组，遗传性稳定，重组DNA也易于分离。四、纯培养获取技术1、whatisculture（培养物）：指在微生物学中在人为规定的条件下培养、繁殖获得的微生物群体；而只有一种微生物的培养物，称为纯培养物（pureculture）。2、主要可分为四类：（1）固体培养基获取法：以固化的培养基为微生物生长的承载体，然后通过：涂布平板法（将已熔化的培养基倒入无菌培养皿内制成无菌平板，待凝固后，将一定量的某一稀释度的样品的悬液滴加在平板表面，再用无菌涂布棒使菌液均匀地分散在平板表面，经培养后即可挑取到单个菌落。）；平板划线法（用无菌接种环以无菌操作蘸取少量的分离材料（一般为涂布后培养所得），在无菌平板表面进行平行划线等连续划线形式，使接种环上微生物细胞数随着划线次数增加而减少，并逐步分散，如果划线适宜的话经培养后，可直接在平板上得到单一菌落。）；稀释到平板法（先将待分离的材料逐级进行10倍稀释，然后分别取不同稀释液少许与已熔化（约50℃）的琼脂培养基混匀，后倒入无菌培养皿，凝固后即可得含菌琼脂平板，培养后可得到菌落。缺点：易使热敏感细菌死亡，也会阻碍一些严格好氧菌的生长）；稀释摇管法（用于分离严格厌氧菌株的稀释倒平板法；先将一系列盛有无菌琼脂培养基的试管加热，是琼脂熔化后保持50℃左右，将待分离的材料用这些试管梯度稀释后，迅速摇匀，冷凝后，在琼脂表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，隔绝空气。）（2）液体培养基获取法：通常采用的液体培养基分离纯化法是稀释法—接种物在液体培养基中进行顺序稀释（较多平行稀释试管），已得到高度稀释效果，是一支试管分配不到一个微生物，如稀释后的试管中没有微生物生长，那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是纯培养物，其中得到纯培养物的稀释度的大多试管（95%）应是物微生物生长。缺点：只能分离出混杂微生物群体中的优势种群。（3）单细胞（孢子）分离法：材料经过一定稀释后在显微镜下用毛细管、显微针（环、钩）挑取单个细胞或孢子。（4）选择培养法：主要是根据目标微生物的生长代谢特点等，制备或可抑制其他微生物的生长或极有利于该微生物生长的环境，从而经一段时间培养后使该微生物数量上升，最后再采取涂布、划线的方法再进一步分离纯化。其方法有两种：选择平板培养基和富集培养（利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定环境条件，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，使人们更容易在自然界中分离到该微生物）。五、基因的转移1、外源基因的导入方法（基因工程转基因方法）：（1）原核细胞的导入：通常可以通过转化、转染或感染等方式将外源基因导入原核细胞。转化：如果外源基因以重组质粒形式存在，可通过转化方式导入；转化基本程序：将一定浓度冰冷的CaCl2溶液处理对数期的大肠杆菌，然后加入外源DNA并在42℃下热休克处理90s，使感受态细胞吸收外源DNA。转染：外源基因以被构建成重组噬菌体DNA或重组噬菌粒，则以转染方式进入宿主细胞；（PS：无论转染还是转化，都要先使宿主细胞转变成感受态细胞，以便吸收外源基因）感染：将重组ƛ噬菌体载体或重组黏粒载体，噬菌体各结构蛋白混合，包装成ƛ噬菌体，然后去感染大肠杆菌。（效率高于转染）（2）真核细胞的导入：导入方法因宿主细胞不同而不同（酵母、哺乳动物、植物）酵母细胞：通常利用蜗牛酶去除酵母细胞壁，使其形成原生质体；再用氯化钙和聚乙二醇处理，使重组DNA以转化方式进入原生质体中；最后将转化后的原生质体置于再生培养基内培养是原生质体再生出细胞壁形成完整的酵母细胞。哺乳动物细胞：较常用也最有效的方法—电穿孔法：将宿主细胞与重组DNA混合并置于电击槽中，在高压脉冲作用下（哺乳动物：250~4000V/cm），使细胞膜瞬时击穿形成微孔，进而重组DNA从微孔进入宿主细胞。（PS：哺乳动物细胞、植物细胞相对有效）方法二：利用病毒载体导入—如把基因插入逆转录病毒载体中，然后将其感染靶细胞，这样就可以