山东大学鸡血红细胞细胞融合

山东大学实验报告2015年3月6日姓名闫于倓班级13级生命基地班学号201300140112同组者：彭旸科目细胞生物学实验题目细胞融合一，实验目的：1、了解动物细胞融合的常用方法。2、学习化学融合的基本操作过程。3、观察动物细胞融和过程中细胞的行为和变化。二、实验用品1、材料鸡血红细胞2、试剂50%PEG、Hank’s溶液（pH7.4）、Alsever’s细胞保存液0.85%氯化钠溶液。3、器材普通光学显微镜、离心机、量筒、载玻片、盖玻片离心管、废液缸等。三、实验原理细胞融合是指在自发或者诱导条件下，两个或两个以上细胞合并为双核或者多核细胞的过程。目前人们已经发现有很多方法可以诱导细胞融合，包括病毒诱导融合、化学诱导融和和电激诱导融合：1、病毒诱导融和：仙台病毒、牛痘病毒、新城鸡瘟病毒和疱疹病毒等可以介导细胞的融时也可介导细胞与细胞的融合。用紫外线灭活后，这些病毒即可诱导细胞发生融合。2、化学诱导融合：很多化学试剂能够诱导细胞融合，如聚乙二醇(PEG)、二甲基亚砜、山梨醇、甘油、溶血性卵磷脂、磷脂酰丝氨酸等。这些物质能够改变细胞膜脂质分子的排列，在去除这些物质之后，细胞膜趋向于恢复原有的有序结构。在恢复过程中想接触的细胞由于接口处脂质双分子层的相互亲和与表面张力，细胞膜融合，胞质流通，发生融合。化学诱导方法，操作方便，诱导融合的概率比较高，效果稳定，适用于动、植物细胞，但对细胞具有一定的毒性。PEG是广泛使用的化学融合剂。3、电激诱导融合：包括电诱导、激光诱导等。其中，电诱导是先使细胞在电场中极化成为偶极子，沿电力线排布成串，再利用高强度、短时程的电脉冲击破细胞膜，细胞膜的脂质分子发生重排，由于表面张力的作用，两细胞发生融合。电诱导方法具有融合过程易控制、融合概率高、无毒性、作用机制明确、可重复性高等优点。四、实验步骤1、鸡血细胞的制备与保存（老师完成）。2、取鸡血1ml+0.85%的NaCl溶液4ml，在1200r/min的离心机内离心5分钟。3、将上一步的沉降血球（去上清液后，约0.1-0.2ml），加入GKN液至4ml，制成细胞悬液。4、有下面两种方法：方法一：取上步得到的细胞悬液1ml，加0.5ml的PEG液，静置5min后摇匀，制片，在显微镜下观察。方法二：取上步得到的细胞悬液0.5ml，加0.5ml的PEG液，静置5min，摇匀,制片，在显微镜下观察。方法三：取上步得到的细胞悬液0.5ml，加1.0ml的PEG液，静置5min，摇匀,制片，在显微镜下观察。五、实验结果方法一：细胞初步凝集细胞初步相接细胞融为一体细胞发生变形（10×40）（10×40）（10×40）（10×40）方法二：细胞初步凝集细胞初步相接细胞融为一体细胞发生变形（10×40）（10×40）（10×40）（10×40）方法三：细胞初步凝集细胞初步相接细胞融为一体细胞发生变形（10×40）（10×40）（10×40）（10×40）六、结果分析1、结果中由于PEG的作用，细胞变形情况较为严重（圆形细胞几乎都变成了椭圆形甚至杆状！）。2、因为PEG作用时间长（计时稍长），细胞受到严重损伤；且混合液粘度较高，没有观察到细胞的运动情况（也未观察到细胞融合状态在随时间的显著变化）。3、因为PEG有的凝集作用，红细胞发生多细胞的凝集反应（大量出现多聚体！）。4、因融合时间短的缘故，基本没有观察到细胞的完全融合。5，细胞变形也有可能是吹细胞沉降物时过于剧烈导致。变形较为明显！6.融合后变形现象较为罕见，只有三组有几个7.有大量多细胞融合的现象出现，且与方法无关：8.查询资料，细胞融合的意义有：在正常的育种过程中，有着远缘杂交不亲和的现象，即不同种的物种间杂交的后代高度不育，就像马和驴杂交产生骡子后，骡子无法产生下一代。如果异种细胞融合后能正常表达的话就可以克服这一育种困难，可以让一个生物同时具有两种生物的性状，因为融合后的细胞拥有两个亲本全套的遗传物质，那样就有了遗传信息上的基础，加上体细胞融合一般都是二倍体融合，那样不会出现无法进行减数分裂的情况，保证了后代的遗传信息的稳定性，让杂交得到的后代的性状成为可遗传的性状。植物的异种细胞融合现在多用于新的植物品种的培育。动物的异种细胞融合现在多用于单克隆抗体的开发，还有膜蛋白的研究。可以说增加了生物的遗传多样性吧！（也为人类开发新性状物种打下了基础）核似乎未完全融合核似乎完全融合疑似为细胞凝聚，非细胞融合七、注意事项1、PEG特性：亲脂性，与质膜结合，改变磷脂双分子层的结构；PEG可使膜脱水，以收缩促进融合；有促使细胞凝集作用。2、PEG对细胞融合的作用效果与毒害作用随着分子量的增加而增大，在实验过程中一般取其分子量800-6000。若做细胞融合培养实验则需考虑融合细胞的成活率，故使用分子量不大于1000的PEG溶液；做细胞融合实验，本次试验中采用分子量为4000的PEG。3、PEG对细胞融合的作用效果和毒害作用随着浓度的增加而增大。在实验过程中一般采用40%-60%浓度的PEG溶液。4、在制备鸡血红细胞时要反复离心洗涤制备的鸡红细胞液以清洗掉杂质八．参考资料《细胞生物学实验》百度百科，豆丁网，