您好,欢迎访问三七文档
范瑾2011年1月14日干扰素是一组具有多种功能的免疫活性蛋白质,主要是糖蛋白,有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节和控制细胞凋亡等作用。除用于动物疾病的辅助治疗外,还可作为免疫佐剂,增强特异性免疫应答。干扰素诱导剂作用于活细胞后,由细胞产生的一种蛋白质,当它再作用于其他细胞时,使其他细胞立即获得抗病毒和抗肿瘤等多方面的免疫力。干扰素具有严格的动物种属特异性,但它对病毒复制的抑制作用是非特异性的,这种作用对生物制品来说,是独一无二的,如猪瘟病毒产生的干扰素,除抑制猪瘟病毒外,对猪的其他病毒感染同样具有抑制作用。一、干扰素基因工程研究进展二、在治疗畜禽疾病上的应用三、最新研究四、干扰素剂型及临床应用国外1.1979年:Taniguch克隆出IFN-β2.1980年:Derynck克隆了人干扰素基因3.1981年:Goeddel报道IFN-γ克隆成功4.1982年:Deuagerr\人工合成干扰素基因并克隆成功1.1982-1985年:侯云德成功表达出干扰素2.陈炬等把人IFN-α基因在烟草植株中表达3.柴玉波构建新型双顺反子表达载体PEC-344.张奉学构建了人IFN-γ植物双元表达载体5.夏春克隆测序了猪IFN-β国内2000年汪明等克隆和测序了肉鸡IFN-α基因并在大肠杆菌中进行了表达,此项研究为重组干扰素用作新型广谱抗病毒生物制剂和免疫增强剂的开发奠定了基础。同年程坚等克隆和鉴定了鸡IFNγ基因,并构建了共表达H9亚型禽流感病毒血凝素基因和鸡IFNγ基因的重组鸡痘病毒。2001年江国托等在感染鸡新城疫病毒的细胞中获得IFNcDNA。并成功在大肠杆菌中表达,为治疗禽病奠定基础。2002年万建青等研究并应用猪重组干扰素γ预防和治疗病毒性疫病,克隆了大白猪IFNγcDNA、构建了毕赤酵母,经鉴定可以抵抗蓝耳病病毒(PRRSV)感染。即酵母表达的重组猪IFNγ是有应用价值的抗病毒生物工程制剂。20世纪70年代末,Sral等的研究首次证明DNA可被动物体细胞摄入,并到达细胞核得以转录。1982年,Will等的实验进一步证明DNA可被高等动物的细胞摄入并表达,而揭开基因治疗的序幕1990年,Wolff等对肌肉直接进行质粒DNA注射发现质粒及外原基因能被吸收并得到表达蛋白产物。1992年,Tang等的实验发现外原基因枪轰击到细胞后,能引起免疫反应。1993年,Ulmer等实验证明核酸疫苗能够诱导产生有效的免疫保护反应1994年,Sekellick等首先克隆出鸡Ⅰ型IFN,并在鼠L(Y)细胞中表达出具有抗病毒活性的ChIFN蛋白。1995年,Schultz等通过E.coli和COS细胞表达了具有较高抗病毒活性的重组ChIFN-α,纯化的E.coli表达产物是鸡Mx基因表达的强诱导1997年,Song等利用E.coli和COS以及CEC-32细胞系分别表达了重组ChIFN-γ,其中COS和CEC-32细胞系表达产物不仅具有抗病毒活性,还能促进巨噬细胞表面抗原Ⅰ类和Ⅱ类MHC的表达。2001年,Yashiro等以brevibacilluschoshinensis为宿主高效表达了ChIFN-γ,产物活性与天然ChIFN-γ相当,其比活性比E.coli和P.pastoris系统的表达产物高3倍。国外夏春、程坚、刘胜旺、吕英姿等人采用PCR技术先后成功实现了丝羽乌骨鸡IFN、惠阳胡须鸡IFN-α、γ干扰素、石岐杂鸡IFN-α、γ干扰素、鸭Ⅰ、Ⅱ干扰素等基因的克隆和序列分析,并发现克隆得到的鸡IFN-α、γ基因的开放阅读框架ORF分别由约579和492个核苷酸组成;同时对禽类IFN基因的同源性进行了分析,确定了一些新的亚型;通过序列比对发现,不同品种鸡的同类IFN核苷酸的同源性在90%以上,相应的鸭IFN的同源性则在70%左右。吴志光等还对鸡α、γ干扰素基因成功地进行了体外重组表达、纯化和活性测定,这些研究为我国禽类的基因文库构建和品种进化分析以及基因工程干扰素的批量生产奠定了基础国内1、猪白细胞干扰素1998年,刘万钧等用Vero传代细胞对猪流行性腹泻病毒(PEDV)进行干扰试验,证明猪白细胞干扰素能有效地抑制PEDV的繁殖活性,在IFN剂量为100U/ml时可明显抑制,1000U/ml可显著抑制,2500U/ml几乎可完全抑制。2、抗新城疫病毒(NDV)2003年,王玉东等报道,发生新城疫后,在相同饲养条件下,采取试验和对照治疗方法,表明使用干扰素、抗生素和多维素治疗的集群停止死亡。3、抗传染性法氏囊病病毒(IBDV)2004年,李风华等报道,发病率为60%26日龄肉鸡用囊病康、黄氏灵等中药治疗,效果不明显,死亡率达12%,后来用干扰素注射,第2天死亡率降到2%,第3天停止死亡,治愈率98%。发生IBD后使用IFN的时间越早,效果越好。2001年,Mo等报道,采用100LD50IBDV的超强毒株HK46感染38日龄的SPF鸡8h后,再012mgrGGIFN-α肌肉注射或分别用011mgrGGIFN-α进行肌肉注射和口服治疗,7天后,使用rGGIFN-α的鸡可成活30%~50%,而未使用干扰素的鸡群仅能成活10%。4、抗禽流感病毒(AIV)2001年,夏春等克隆和鉴定了我国三黄鸡干扰素基因,并用QIAexpressIV原核表达系在M15工程菌中表达了N′端含6个组氨酸(6-His)的融合蛋白。在鸡胚实验系中6His-rGGIFN-α抗禽流感病毒效果好。5、治疗马立克氏病(MD)2004年,李风华等报道,临床诊断为MD的病鸡,用IFN按500只/瓶加白细胞介素-2(500只/瓶)肌肉注射,3天后鸡群状态好转,康复较好。6、抗弓形虫IFN-γ是细胞介导免疫的重要免疫分子,不论是外源性IFN-γ,还是内源性的IFN-γ,都表现了强大的抗虫效应,外源性的IFN-γ具有强大的抗感染效应,内源性的IFN-γ在阻止弓形虫增殖、促使休眠状态弓形虫包囊形成、防止包囊的活化突破等方面具有重要的作用。在畜禽疾病上的应用最新研究表明,丁酸钠、胰岛素、羟甲基淀粉钠、氯化钙以及许多中草药,如黄芪、刺五加等可以提高诱生IFN的能力。干扰素的剂型及临床应用:1、INFα、22a、22b、2β、2nl、γ的注射剂、冻干粉针剂干扰素栓剂2、重组人干扰素α22b(rhINFα22b)凝胶剂3、重组人干扰素滴眼液4、干扰素C辅助治疗耐多药结核病5、干扰素喷雾剂6、干扰素涂剂7、长效干扰素8、干扰素滴鼻剂、膜剂9、干扰素舌下含片总RNA提取PCR扩增重组表达载体的构建诱导表达及纯化表达蛋白的SDS-PAGE电泳表达产物的werstern-blot检测一、对IFN表达载体的改进进一步研究,以发现更稳定更高效的表达载体。国内原核表达主要是融合表达和全基因表达,我们也可以利用在蛋白基因两侧设计引物扩增得到的基因与原核非融合性表达载体重组表达。20世纪90年代就有很多人开始改造干扰素的表达载体,以使其更有效地表达。作为表达系统的大肠杆菌及酵母是高产并价廉的。因此,IFN的生产多利用这两种微生物,但这两种微生物缺乏翻译后调控途径。所以很多人开始研究利用哺乳动物表达系统对IFN进行表达。通过PCR可从人类基因组DNA中克隆IFN基因,并通过哺乳动物表达系统在MutineMyelomaNSO细胞中表达。这种表达系统的较为稳定,表明该哺乳动物表达系统是理想的表达系统,但此方法产量较低,因此需要进一步改善。二、蛋白质工程干扰素蛋白质工程干扰素是干扰素分子生物学发展的产物,人们可以按着其意想设计出不同于自然干扰素的新型干扰素。PEG化的方法用来延长干扰素的半衰期,已经取得了很好的效果,并且有些药物已经上市。血清白蛋白融合干扰素在延长干扰素的半衰期效果上比PEG修饰更有效,所以值得关注和深入研究。二、试验方法上的改进可以采用Nest-PCR,即巢式PCR技术,可提高扩增产物量,减少操作步骤,降低交叉感染。[1]叶伟成.绍兴鸭α2干扰素基因克隆、表达及活性测定[J].浙江农业学报,2005.[2]曲福军等.BMP7基因克隆及其在兔关节软骨细胞中的表达[J].吉林大学学报,2006.[3]台玉磊等.猪干扰素IFNE1基因克隆及重组表达载体的构建[J].农业生物技术科学,2008.[4]曹瑞兵,周斌.猪γ干扰素的基因克隆、改造、表达及活性测定[J].南京农业大学学报,2003.[5]曹瑞兵等.鸡γ干扰素成熟蛋白基因的表达及其产物抗病毒活性测定[J].中国病毒学,2004.[6]陈斌,程安春.麻鸭α干扰素基因的克隆与序列分析[J].中国兽医学报,2006.[7]黄宝成等.人肝癌细胞cDNA文库的构建及鉴定[J].第四军医大学学报2000,21卷,2期.[8]田萌.猪瘟病毒C株cDNA构建[J]北京大学政学者论文集,2003.[9]刘志国.基因克隆的分子基础与工程原理[M]北京:化学工业出版社.[10]夏其昌.蛋白质电泳技术指南[M].北京:化学工业出版社.[11]陈宏.基因工程实验技术[M].北京:中国农业出版社,2005.[12]叶智钊,黎敏英,邓树轩.干扰素研究进展[J].畜牧与饲料科学,2009.[13]谭云等.干扰素的功能和制备方法[J].生物学教学,2010.[14]银晓,关原平.干扰素的研究进展[J].畜牧科学,20o8.[15]张继瑜,赵荣材.细胞因子基因工程药物研究应用进展[J].中国兽医科技,2001.[16]陈妍,潘小玲.重组干扰素的研究进展[J].国际免疫学杂志,2008.
本文标题:干扰素的研究进展
链接地址:https://www.777doc.com/doc-2489071 .html