安徽农业大学基因工程

1复习题1.为什么说基因工程技术是上世纪60年代末70年代初发展起来的？因为：（1）1967年发现了连接酶；（2）大肠杆菌的转化技术是1970年获得突破；（3）限制性内切核酸酶的分离始于1970年；（4）Berg在1972年构建了第一个重组的DNA分子。2.重组DNA的含义是什么？将一个生物的DNA片段插入到一个载体中，并引入到另一个生物体中进行繁殖。3.限制性内切核酸酶的切割频率？切割频率是指限制性内切核酸酶在DNA分子中预测的切点数。假定DNA分子中4种碱基的频率相同，且限制性内切酶的识别位点随机分布，那么任何一种限制酶的切割频率，理论上应为1/4n，n为该限制酶识别的碱基数。4.什么是细菌的限制-修饰系统？它有什么意义？细菌中有作用于同一DNA的两种酶，即分解DNA的限制酶和改变DNA碱基结构使其免遭限制酶分解的修饰酶，这两种酶作用于同一DNA的相同部位，把这两种酶所组成的系统称为R-Msystem。不同种的细菌或不同的细菌菌株具有不同的限制酶和修饰酶组成的R-Msystem。修饰的本质是通过甲基化酶将DNA中某些碱基进行甲基化修饰，由于宿主自身DNA上的这些位点进行了修饰，限制酶就不能进行切割，而外来的DNA在相应的碱基上没有被甲基化，宿主的限制酶通过对该位点的识别来分辨敌我，并将入侵的外来DNA分子降解掉。所以DNA的限制和修饰作用为细菌提供了保护，它是通过对外源DNA的限制和对自身DNA的修饰实现的。5.碱性磷酸酶的种类、差别及用途？CIP的活性比BAP高10-20倍，且加热到68℃就可完全失活，而BAP却是耐热酶，耐酚抽提。用途：（1）dsDNA的5’端脱磷酸，防止线性载体DNA的自身环化。（2）DNA和RNA脱磷酸后，用于多核苷酸激酶进行5’末端标记。6.如何利用T4DNA聚合酶制备平末端？T4DNA聚合酶具有5，-3，合成酶活性和3，-5，外切核酸酶活性，并且在高浓度的dNTP存在时，降解作用即会停止。根据这一特性可以调整反应条件，用T4DNA聚合酶的3，-5，外切酶活性将具有3，突出末端的双链DNA切成平末端；用T4DNA聚合酶的5，-3，合成酶活性将具有5，突出末端的双链DNA填补成平末端。（而Klenow酶是由大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ全酶经枯草杆菌蛋白酶水解之后，产生的分子量为76kDa的大片段分子。Klenow酶仍具有5，-3，的聚合酶活性和3，-5，的核酸外切酶活性，但失去了全酶的5，-3，的核酸外切酶活性，且3，-5，的核酸外切酶活性很弱，故仅可对3’，-隐蔽末端的双链DNA填补成平末端。）7.理想质粒载体必须具备的条件？（1）具有复制起点，这是质粒自我增殖所必不可少的基本条件，可使繁殖后的细胞维持一定的质粒拷贝数。（2）带有抗菌素抗性基因，最好具有两种抗菌素抗性基因，且抗性基因内有若干单一的酶切位点，便于利用插入失活法筛选重组体。（3）具有若干限制酶单一识别位点，这样可以有选择地供带有不同末端的外源DNA定点插入。（4）较小的分子量和较高的拷贝数，小分子量的质粒易于操作，更能抵抗机械剪切力的切割，可容纳外源DNA片段也更长（不超过15kb），且可有效地转化给受体细胞；小分子量的质粒往往属于松弛型质粒，在细胞中拷贝数较高，扩增后回收率高。8.质粒改造包括哪些基本内容？a.删除一些非必要区段及对宿主有不良影响的区段，削减载体分子量，使载体具有更大的容纳外源片段的能力；b.加上易于选择或检测的标记；c.限制性内切酶酶切位点的改造，便于外源基因插入到载体中的特定位置；d.加上一些调控元件，有利于克隆基因的表达；e.安全性改造，限定载体的宿主范围。9.为什么野生型的λ噬菌体DNA不宜作为基因工程载体？野生型的λ噬菌体DNA，分子量大，对常用的核酸内切限制酶具有过多的酶切位点（如5个EcoRⅠ限制位点，7个HindⅢ限制位点），没有选择标记，而且具有感染性，显然它本不适于用作基因克隆的载体，因此有必要将λ噬菌体的非必要（J基因到N基因）区段和多余的酶切位点进行删除，以便改造成适用的克隆载体。10.黏粒载体具有哪些特点与不足？a.柯斯质粒载体具有质粒复制子，因此进入寄主细胞后能够像质粒一样进行复制，并且能在氯霉素作用下进一步扩增。b.具有质粒载体的抗生素抗性基因。c.具有λ噬菌体的包装和转导特性。d.容载能力大。克隆的最大片段为45kb，最小片段为19kb。2用cosmid进行克隆时有两个缺点：（1）两个或多个cosmid分子之间的重组，即自我重组降低了重组率。（2）两个或多个外源DNA片段同时插入。11.PCR的基本原理是什么？PCR反应是在模板DNA、引物和dNTPs存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应，它根据DNA半保留复制的原理，在体外进行DNA的变性、复性（退火）和引物延伸反应。12.欲扩增下图所示的两段序列之间的DNA，请从所列出的的引物中选出合适的一对。（1）、（8）。5’-GACCTGTGGAAGC-------CATACGGGATTG-3’3’-CTGGACACCTTCG-------GTATGCCCTAAC-5’a)引物1：（1）5’-GACCTGTGGAAGC（2）5’-CTGGACACCTTCG（3）5’-CGAAGGTGTCCAG（4）5’-GCTTCCACAGGTCb)引物2：（5）5’-CATACGGGATTG（6）5’-GTATGCCCTAAC（7）5’-GTTAGGGCATAC（8）5’-CAATCCCGTATG13.引物设计的一般原则是什么？a.长度15～30bp，Tm55℃～75℃。b.G+C占50%～60%，避免单一碱基的连续排列，一般两端G+C含量近似。c.引物3’端必须与模板DNA互补。d.一对引物间不能有4个以上的碱基互补。e.引物本身应避免有回文序列。14.对于已知序列基因的克隆方法主要有:（1）根据已知序列，设计特异性引物进行PCR扩增，如果序列不是全长基因，可通过5’RACE和3’RACE对其基因的两端进行扩增测序，最终获得全长基因序列。（2）根据已知序列制备探针，利用该探针与该生物DNA文库或cDNA文库进行杂交，筛选目的序列所在的克隆，测序分析后，从克隆上获得目的序列全长基因。15.有哪些可能的原因使一个基因在DNA库中丢失？a.假定这个基因在高拷贝数的载体上，由于它的产物太多，而对宿主是有毒的；b.在部分消化中，某个基因中含有所用酶的切点；c.酶切位点离基因太远，结果由于DNA片段太长而不能有效地克隆。16.DNA重组连接的方法大致分为四种：黏性末端连接，平末端连接，同聚物接尾连接，人工接头连接。其中黏性末端连接法是最常用的连接方法，具有实验操作简单，易于回收外源DNA片段的优点，而不足之处：（1）载体易自身环化；（2）用同一种限制酶产生的黏性末端连接不易定向克隆；（3）难插入特定的基因；（4）大片段DNA的重组率较低，即使用碱性磷酸酶处理了载体，载体也有成环的倾向；（5）用这种方法产生的重组体往往含有不止一个外源片段或不止一个载体连接起来的串联重组体，增加筛选工作的困难。17.什么是同尾酶？为什么说用同尾酶进行体外重组效率最高？同尾酶是又一类限制酶，它们虽然来源各异，识别的靶子序列也各不相同，但却产生相同的粘性末端。用同尾酶处理载体和外源DNA得到的粘性末端可以像完全亲和的粘性末端那样进行连接，不同的是连接后的产物往往失去原有的限制性内切核酸酶的切点，却又能被另外一种同尾酶识别。用同尾酶进行体外重组时，在限制酶切割反应之后不必失活原有的内切酶，即可直接进行重组连接。由于连接体系中存在原有的限制酶，载体就不会自连，从而保证了载体同外源DNA的连接。所以在用同尾酶进行的连接反应中不必用碱性磷酸酶进行载体的脱磷反应而得到最高的连接效率。反应中通常涉及三种不同的限制酶，其中两种是识别六碱基的酶，另一种是识别四碱基的酶。18.什么是受体细胞的感受态？常用的诱导方法有哪些？接受外源DNA的生理状态；化学法（CaCl2）、电击法。19.某一质粒载体具有Tetr和Kanr的表型，在Kan抗性基因内有一BglⅠ的切点。现用BglⅠ切割该载体进行基因克隆，问：（1）转化后涂皿时应加什么样的抗生素？（2）培养后长出的菌落具有什么样的抗性基因型？（3）如何利用抗性变化筛选到含有插入片段的重组体？（1）加四环素（Tet）；（2）TetrKanr和TetrKans；（3）将生长在含Tet平板上的菌落，重新点种在含Kan的平板上，选择只在Tet平板上生长而不在Kan平板上生长的菌落，即为所需的重组体。320.简述农杆菌介导法的转基因基本原理及其优缺点。农杆菌介导法的基本原理是利用农杆菌的Ti质粒为载体，通过农杆菌感染植物受体细胞将外源基因导入受体细胞，借助T-DNA与受体基因组交换将外源基因整合到受体基因组上从而实现遗传转化。农杆菌介导的优点：（1）模仿天然载体转化系统，成功率高，效果好；（2）可以转化较大的完整的DNA片段至植物基因组中；（3）外源基因在受体中多数为单拷贝，稳定性好。缺点：受宿主范围的限制，主要适应于双子叶植物，单子叶植物效果较差。21.简述基因枪法的转基因基本原理及其优缺点。基因枪法是在真空条件下，利用粒子加速器将外面包裹了外源基因DNA的金粉颗粒打入完整的受体细胞，使外源基因在受体细胞中实现遗传转化。基因枪法优点：（1）不受植物宿主范围和组织类型的限制；（2）操作简便；缺点：（1）转化频率不高；（2）外源基因在受体中多数为多拷贝；（3）成本较高。22.Northern和Southern的根本区别在于：（1）印迹对象不同：Northern是RNA，而Southern是DNA；（2）电泳条件不同，Northern变性条件，Southern是非变性条件（酶切）。在Southern印迹中，DNA转移的速度主要取决于DNA片段的大小和琼脂糖凝胶的浓度。23.放射免疫筛选的原理基于哪三点？a.抗体分子可以牢固地吸附到固体支持物（如聚乙烯塑料）上；b.同一个抗原可以同几种不同的抗体结合；c.抗体分子可以通过碘化作用被I125标记。24.如何防止载体DNA分子的自身环化问题？a.利用碱性磷酸酶处理线性载体分子；b.使用同尾酶产生的粘性末端连接，可以自动地防止线性载体DNA分子的自身环化；c.采用同聚物加尾连接技术，使线性DNA分子的两个3′-OH末端，因具有同样的碱基结构而无法自身环化；d.应用柯斯质粒，亦可防止质粒DNA分子发生自身再环化作用。25.下面几种序列中你认为哪一个（哪些）最有可能是Ⅱ类酶的识别序列：GAATCG，AAATTT，GATATC，ACGGCA。为什么？AAATTT，GATATC，因为它们是回文序列。26.Sanger双脱氧法测序的原理？（1）以双脱氧的底物取代正常的DNA合成底物掺入到正在合成的新链上；（2）由于是双脱氧，将不能同下一个脱氧单核苷酸形成磷酸二酯键，从而使合成终止。27.分离DNA时，为什么要在缓冲液中加入一定浓度的EDTA与蔗糖？（1）EDTA是螯合剂，可同Mg2+离子螯合，使核酸酶失去了作用的辅助因子，而抑制核酸酶的活性；（2）蔗糖可增加缓冲液的黏度，保护DNA不易断裂。28.抽提DNA去除蛋白质时，怎样使用酚与氯仿较好？酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂的比重更大，保留在最下层。作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10%～15%的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA，且单独用酚抽提DNA不能完全除去酚，而残留的酚抑制限制性内切酶和连接酶活性，甚至导致酶变性，而氯仿也是蛋白变性剂，变性作用虽不如酚效果好，但它不与水互溶，不会带走DNA，而与苯酚互溶，故可带去残留酚。所以在抽体过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。29.