实时定量PCR

实时定量PCR用于基因的定量分离前言：目前许多关于定量PCR的实验报道证实了定量PCR由一门实验技术向科学研究的大的方向的转变。定量PCR有许多用途：测量mRNA表达的水平，DNA的拷贝数目，转基因的拷贝数目和表达分析，等位基因的鉴定和测量滤过性病毒的浓度测定。实时定量PCR的用途的应用范围非常广阔，而且它能够对菌种的增殖过程中低成本的反应器和反应物进行检测。成功的运用实时定量PCR并不是需要耗费很大的资金。这一篇综述能够通过限制这种技术的多种因素的分析来引导读者。对实验设计，模板准备，分析方法仔细的考虑对于精确的基因定量分析是非常重要的。正文：在网上通过搜索关键词“定量PCR”或者“实时PCR”可以得到几千个结果，这足可以证明这项技术已经成为许多科学领域的主流研究方向。如果同一个搜索要在几年以前完成，那么得到的搜索结果只有几百个。是什么原因使得运用这种实验技术的论文增加的如此之快呢？第一个有关于实时PCR的文献发表于1993年[1]，那个时候这种实验技术还没有成为主流的实验技术。最主要的原因可能是实验仪器资金上巨大的耗费，而且在运用实时定量PCR研究可增殖的对象时候麻烦会更多，而实时PCR最近才被广泛的运用为一项有用的技术。随着市场上实时PCR仪器越来越多，这类仪器和反应物的价格也越来越便宜，更多的人现在选择了这项技术。将标准PCR甚至半定量PCR的知识简单的拓展已经不足以设计和分析这类试验。在运用实时PCR时候再也不是仅仅看到凝胶上面的一个条带就足以了，要得到一个确定的结果还需要更多调控。PCR反应能够对模范链进行指数似的拷贝。由于反应过程中模板，反应物的限制，或焦磷酸分子产物对于DNA聚合酶的抑制作用，以至PCR反应最后不能够指数似的拷贝模板，而且其他反应的产物会产生比目的产物更多。这是为什么PCR反应终止时候的产量总是难以确定。能够对在PCR反应正在聚集的过程中产量的进行测量，或者能够实时的测量，那么就能够在PCR指数期反应的时候测量某一个点的产物的量。也只有通过指数期反应外推回去才能够知道起始的模板的数量。在实时PCR反应的指数期通过所有样品的比较而确定了一个荧光信号起始值。这个起始值能够作为参照的荧光值,并且当样品信号明显的大于参照的荧光值这个荧光信号起始值就被绘在图上。因此，PCR循环的每一个部分需要产生足够的荧光信号才能够达到这个起始值所经历的循环数目，或者Ct（cyclethreshold）。Ct值正比于起始的模板的数量而且也是计算mRNA表达水平或者DNA拷贝数的计算的基础。什么是实时定量PCR？实时定量PCR是对聚合酶链式中正比于反应前模板数量的反应产物的一种可靠的检测方法和测量方式。要达到这个目的，需要有一种检测PCR反应聚集产物的方法和一台能够执行热循环并且能够实时记录每一个PCR循环结果的仪器。在实时PCR仪器问世以前，要完成定量PCR，需要在以经验判断PCR循环的数目内用溴化乙锭（EthidiumBromide）（或者其他的能够插入碱基的染料）插入DNA碱基对之间将PCR产物可视化。这些产物需要在标准的琼脂糖凝胶上跑电泳还要通过光电成像或者其他的密度测量方式使产物量化。后来极具竞争力的PCR反应拥有一些定量的能力，但是即便拥有这些办法仍然还不能够称为方便，稳定，可以信赖的定量方法。第一篇报道实时PCR的实验，1993年Higuchi在PCR反应过程中通过溴化乙锭的插入和一台经过改良的热循环仪，用UV射线照射样品然后通过CCD相机检测产生的荧光值。检测的荧光信号值被作为检测PCR反应周期的一种手段。经过绘图的结果（如图1所示），该图对PCR每一个循环的产物数量给予了一个很好的预测（除了那些早期循环时候荧光信号值处于CCD相机识别范围以下）。这种方法的主要缺陷，不是采用强烈致癌物类似于溴化图一：一个假设的扩增图谱阐明了实时定量PCR实验中术语的应用。这个扩增图以荧光信号和PCR循环数目为轴作图。基线是指信号开始聚集的PCR循环数而位于仪器的识别范围之内。在PCR循环中测量的信号用于绘制起始值。起始值一般为对应荧光信号基线平均信号值的标准偏移值的10倍。在标准值上方被发现的荧光信号能够被用来定义一个样品的起始周期（Ct）。Ct值定义为每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数。不同样品的Ct值用于计算每一个样品的相应的模板含量。图中实线跨过PCR循环数目18的起始值点划线跨过PCR循环数为20的起始值。用20减18，那么两个样品有2个循环的差别或者说△Ct＝2。由于PCR反应指数式增长的本质，△Ct值要减2或者将差值乘4才能够将△Ct线形化。这种算法用于相对定量分析。乙锭，而在于一些非特异的PCR产物同样被检测到而包含在被测的荧光信号值总量之中。现今，化学方法通常采用5′核酸酶方法，用到TaqMan探针，分子标记，SYBRGreenI插入碱基的染料。还报道了一些其他的方法；但是在任何情况下，在PCR反应过程中产生的荧光信号能够被各种不同的实时的PCR仪所吸收。由于这种额外的特异性，增加一个杂交的探针能够使得实时定量PCR更加的稳定。5′核酸酶方法通过裂解5′靶位点的寡聚核苷酸而产生荧光信号（TaqMan探针，AppliedBiosystems，CA，USA）。AppliedBiosystems采用了一种新型号的TaqMan探针，该系统在3′使用“次最佳连接（MGB）”从而降低探针的解链温度，因此使得探针能够明显的变得更短并增强探针在等位基因识别中的作用。此外，这些探针能够判定一个特异的等位基因的表达水平达到排除仅仅只有一个核苷酸差别的顺反子（未正式出版的报道）目前市场上有许多中实时PCR仪；其中包括ABI7700，BI7900，BI7000(AppliedBiosystems)，MX4000(Stratagene，aJolla，CA，USA)，Lightcycler(Roche，Alameda，CA,USA)，iCycler(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)，Smartcycler(Cepheid，Sunnyvale，CA，USA)，Robocycler(MJResearch，InclineVillage，NV，USA).目前最普遍的并且市场占有最大的是AB7000，它取代了ABI7000和ABI7900。ABI系列仪器的主要优点在于它能够采集“被动参照”信号数值并能够在反应系统中对每一次反应光学变化规格化。MX4000也能够通过软件轻易的完成对每一个变化值进行补偿，它还能够完成多元反应，最多能够在一个试管中完成三个不同的PCR反应。虽然对比和比较市场上所有的仪器已经超出了这片综述文章的讨论范围，但是必须要清楚什么时候买什么型号的仪器。所有这些仪器都能够完成实时PCR，然而他们不都是一样的。在做选择的时候花费不是唯一的因素；便宜一些的仪器不能够对光学变化值进行补偿因而不能够检测出微小的变化。高产量的器材可能超过你的需求（例如AB7900）；它拥有384个孔洞，它能够实施大批量的等位基因检测。做出选择时候你需要极大的小心和调查；有必要依据你的需要比较各种仪器的性能。定量PCR的一般运用实时定量PCR的用途是非常多的。这些用途包含：mRNA表达研究，基因组DNA和滤过性病毒DNA拷贝数的测量，转基因拷贝数，等位基因识别实验，基因微阵列数据的证实。还有一些最新的用途，包括特异结合不同基因的表达分析和激光捕捉显微解剖物质；石蜡包埋组织；分化细胞（包括干细胞）；或者单细胞中随即扩增的RNA，这些应用表现了这项技术运用于限量样品的表达分析研究的灵敏度。图二：在实时定量PCR中产生荧光信号的。虽然还有其他的办法，但是这种办法在实时定量PCR中是最常用的。（A）在5′核酸酶方法利用TaqDNA聚合酶5′到3′外切酶活性，典型的TaqMan探针产生信号。这种探针能够在标准的PCR引物之间杂交模板。与其他的探针裂开之后，5′染料分子在接近淬火分子例如TAMRA（6－四甲基若丹明）时候发生淬火反应而发生脱离。5′染料分子可以采用不同的分子而6－FAM分子一般是最常用的。（B）分子标记。这个类似于TaqMan探针，它使用淬火的方式来避免一些不要的荧光信号，虽然采用直接的能量传输方式。但是，不同的是，在和模板杂交的时候它不是通过5′外切酶活性而裂开的。增加的发卡结构能够提供淬火效应。在杂交的时候，5′端的染料分子和淬火分子之间的距离（一般是DABCYL）要足够的大才能够才有最小的淬火信号。在PCR退火状态时候信号必须要分析。（C）SYBRGreenIDNA结合染料。当采用这种办法时候没有必要设计第三个寡核苷酸或者杂交探针。在染料分子结合了DNA分子（通过此最佳状态的结合DNA双链），荧光信号只有在样品受到光源激活的时候才能够发射出荧光信号。这是这个办法最节约的地方，但是它不能够在使引物不形成引物二聚体这个方面优化PCR反应。SYBRGreenI染料不能够识别天然的模板和人造模板，不像TaqMan探针或者分子标记。实时定量PCR运用于血液学实验的特殊用途实时定量PCR已经用于一小部分此类研究中并且在一些杂志上发表。然而，随着目前实时定量PCR雨后春笋般地被运用研究中，它在血液学中发挥更大的潜力只是时间问题。典型的例子包括转基因产物的测量，白血病基因DNA拷贝数的测量，免疫反应细胞分化的关键基因mRNA表达水平的分析。对于最小限度残余疾病的检测血液肿瘤表现为基因的转移，能够用作肿瘤标记监控对治疗的反应。治疗的选择包括化学疗法，放射疗法，或者骨髓移植。通过这几十年的这些进步大大地增加了这些病人存活的几率。然而，复发仍然是完全康复的一大难题。因而，对于最小限度残余疾病的检测是进一步的改良治疗的方案的关键步骤[29，30]。实时定量PCR的应用已经成为检测这些复发症状的分子反应，并且能够从病人分子水平的表现来引导治疗的方案。因此定量的反应能够用于确定反应产物的量和临床治疗效果的关系。有一个典型的例子，急性成瘤细胞白血病转录因子（AML）－1于第8号染色体发生融合，这被称之为倒位t(8;21)(q22;q22)，很有可能就是AML疾病中主要的染色体畸变。这种由AML－1普通的转录水平的调控所造成的畸变很有可能导致了白血病的发生。虽然对于许多AML病人有着可喜的治疗成果,但是很大比例的病人又旧病复发。而且，那些没有复发的病人采用标PCR反应对于AML－1/MTG－8转录融合反应结果仍然是阳性。这可能受限于难以发现微量的白血病前期细胞，标准PCR反应技术不能够满足病人，因为融和产物的量可能是更好的一种指示剂。因此，目前的研究[31，32]已经展示出实时定量PCR用来检测融和产物有助于鉴别那些病人可计量的最小限度残余疾病，并且对于指示剂和治疗方案选择的估计都证实是有价值的。类似的研究也应用于其他的转座融合转录产物的量化，例如BCR－ABL在慢性骨髓白血病（CML）[33，34]中决定了CML病人[36]对于α－干扰素的反应。将白血病特化端粒－AML-1融合的转录水量化用于儿童急性成淋巴细胞白血病（ALL）复发的预测或者测量最小限度残余ALL疾病，可以采用定量PCR的办法。此外，实时定量PCR已经用于量化染色体转位t(14;18)(q32;q21)[40,41]；卵泡淋巴瘤（FL）病人bcl-2基因的重组；或者干细胞治疗非霍奇金氏淋巴瘤的效果。这种办法也能够应用对普通人外周血液中bcl-2基因的重组从而作为判断这种背景重组水平怎样影响鉴定患有卵泡淋巴瘤（FL）的病人[43]。许多这类的研究都很大程度上受益于实时定量这种方法的应用。随着高度灵敏定量PCR实验手段的采用，将分子的反应关联作为临床诊断可能现在就实现了。白血病DNA拷贝数的测量DNA拷贝数的测量对于判定引发许多恶性肿瘤的染色体不平衡的程度是很重要的。有许多种办法测量肿瘤的DNA拷贝数；每种办法都有特定的优点和缺点。染色体组CGH能够探测整个染色体的不平衡性，但是分辨率很低。荧光原位杂交（FISH）对特异行为的细胞提供拷贝数的测量，但是原位杂交不能够