实时荧光定量PCR技术

实时荧光定量PCR技术1样品RNA的抽提①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。2RNA质量检测1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。①浓度测定A260下读值为1表示40?gRNA/ml。样品RNA浓度(?g/ml)计算公式为：A260×稀释倍数×40?g/ml。具体计算如下：RNA溶于40?lDEPC水中，取5ul，1:100稀释至495?l的TE中，测得A260=0.21RNA浓度=0.21×100×40?g/ml=840?g/ml或0.84?g/?l取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35?l，剩余RNA总量为：35?l×0.84?g/?l=29.4?g②纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。2）变性琼脂糖凝胶电泳测定①制胶1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10ml的10×MOPS电泳缓冲液和18ml的37%甲醛溶液(12.3M)。10×MOPS电泳缓冲液浓度成分0.4MMOPS，pH7.00.1M乙酸钠0.01MEDTA灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25?l溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。②准备RNA样品取3?gRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10?g/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。③电泳上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。5-6V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3cm。④紫外透射光下观察并拍照28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。3样品cDNA合成①反应体系序号反应物剂量1逆转录buffer2μl2上游引物0.2μl3下游引物0.2μl4dNTP0.1μl5逆转录酶MMLV0.5μl6DEPC水5μl7RNA模版2μl8总体积10μl轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。②混合液在加入逆转录酶MMLV之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5μl，37℃水浴60分钟。③取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。4梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（β-actin）实时定量PCR①β-actin阳性模板的标准梯度制备阳性模板的浓度为1011，反应前取3μl按10倍稀释（加水27μl并充分混匀）为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。②反应体系如下：标准品反应体系序号反应物剂量1SYBRGreen1染料10μl2阳性模板上游引物F0.5μl3阳性模板下游引物R0.5μl4dNTP0.5μl5Taq酶1μl6阳性模板DNA5μl7ddH2O32.5μl8总体积50μl轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。管家基因反应体系：序号反应物剂量1SYBRGreen1染料10μl2内参照上游引物F0.5μl3内参照下游引物R0.5μl4dNTP0.5μl5Taq酶1μl6待测样品cDNA5μl7ddH2O32.5μl8总体积50μl轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。③制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93℃2分钟，然后93℃1分钟，55℃2分钟，共40个循环。5制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板①针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。反应体系：序号反应物剂量110×PCR缓冲液2.5ul2MgCl2溶液1.5ul3上游引物F0.5ul4下游引物R0.5ul5dNTP混合液3ul6Taq聚合酶1ul7cDNA1ul8加水至总体积为25ul轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。35个PCR循环（94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟）；72?C延伸5分钟。②PCR产物与DNALadder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。③将PCR产物进行10倍梯度稀释:将PCR产物进行10倍梯度稀释:设定PCR产物浓度为1×1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。6待测样品的待测基因实时定量PCR①所有cDNA样品分别配置实时定量PCR反应体系。体系配置如下：序号反应物剂量1SYBRGreen1染料10ul2上游引物1ul3下游引物1ul4dNTP1ul5Taq聚合酶2ul6待测样品cDNA5ul7ddH2O30ul8总体积50ul轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。②将配制好的PCR反应溶液置于RealtimePCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为：93℃2分钟预变性，然后按93℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40做个循环，最后72℃7分钟延伸。7实时定量PCR使用引物列表引物设计软件：PrimerPremier5.0，并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。8电泳各样品的目的基因和管家基因分别进行RealtimePCR反应。PCR产物与DNALadder在2％琼脂糖凝胶电泳，GoldView?染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。