实验11_朱奇_2012011910

实验11朱奇2012011910质粒DNA的提取和琼脂糖凝胶电泳朱奇化222012011910实验日期2014/12/31一.实验目的1.掌握碱裂解法提取质粒的原理和方法；2.掌握琼脂糖凝胶电泳分离鉴定DNA的原理和方法。二.实验原理常用的质粒DNA分离方法有3种：碱裂解法、煮沸法和去污剂裂解法。前两种方法比较剧烈，它们可以破坏碱基配对，使宿主细胞的线性染色体DNA变性，而共价闭合环状DNA由于拓扑缠绕，两条链不会互相分离。当外界条件恢复正常时，质粒的DNA双链又迅速恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，其大小范围在1~200kb。所以，质粒DNA提取与纯化是最基本的分子生物学实验技术，而碱裂解法提取的质粒产量高、纯度好，是一种最为常用的方法。碱裂解法提取质粒的实验原理是在pH12.0~12.6碱性环境中，细菌的线性大分子质量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子质量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片及染色体DNA、RNA和蛋白质，质粒DNA尚在上清液中，收集上清液即可得到富集的质粒DNA。在通常情况下，线状DNA分子在一定浓度琼脂糖介质中泳动的速度与其分子质量的对数成反比。因此，利用DNA分子长度（bp）的负对数与泳动距离作图，对于DNA片段分子质量测定方便而准确。样品经电泳后形成的条带必须经过染色后才能被显示出，以进行分析和检测。观察琼脂糖凝胶中DNA的最简便方法是利用荧光染料进行染色。荧光物质含有一个可以嵌入DNA碱基之间的平面基团，DNA与之结合后在紫外线照射下呈现荧光。三.实验仪器与药品3.1主要器材电子天平、冰箱、超净工作台、摇床、高速离心机、微量移液器、微量离心管、微波炉、琼脂糖凝胶电泳仪（DYY-6C型，北京市六一仪器厂）、紫外凝胶成像系统（DNRBio-ImagingSystems）、封口膜、一次性手套。3.1主要试剂1.菌种：含有pET28a质粒或含有pUC19质粒的大肠杆菌Top10，卡纳霉素抗性。2.LB液体培养基：酵母浸膏5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl10g/L，pH7.03.卡纳霉素：100mg/mL实验11朱奇20120119104.Plasmidminikit质粒小量提取试剂盒（Biomiga公司）5.琼脂糖：电泳级6.DNAMarkerIV，由6条线状双链DNA条带组成，分别为7000、5500、3500、2000、1000和500bp7.GoldViewTM核酸染料（赛百盛）8.TAE溶液：40mmol/LTris-乙酸盐，1mmol/LEDTA9.10×点样缓冲液（LoadingBuffer,Takara）四.实验方法4.1菌体培养（前期准备工作）将50μL甘油中保存的菌液接入固体LB平板37℃过夜培养，挑取单菌落接入10mL液体LB培养基（其中卡纳霉素的浓度为50μg/mL），37℃，200rpm过夜培养。4.2质粒提取按照Plasmidminikit质粒小量提取试剂盒（Biomiga公司）进行操作：1.37℃过夜培养的菌液1~4mL13000rpm离心1min，收集菌体，并尽可能的去除上清，以防止后面菌液裂解不充分和沉淀不完全的情况；2.使用250μlBufferA1充分重悬沉淀；3.加入250μlBufferB1后反转离心管使液体混合均匀，然后静置4min，最好出现溶液粘稠且澄清的现象，否则可以考虑加大B1的量或者减少菌液的量；4.加入350μl冰箱预冷的BufferN1后立即反转多次至溶液充分混匀，出现白色絮状沉淀后放置于冰箱中静置10min；5.室温下13000rpm离心10min，一次到多次直至上清中没有沉淀为止，然后将上清转入带有已平衡好的DNA柱中，放置于收集管中室温下13000rpm离心1min，，重复两次后弃滤液；6.向DNA柱中加入500μlBufferKB，室温13000rpm离心1min，倒掉收集管中的滤液；7.向DNA柱中加入500μlDNAWashBuffer，13000rpm室温离心1min，重复两次后弃滤液；8.开盖后室温13000rpm离心5min，或者置于超净台中风干残留的乙醇，以保证最后的洗脱效率；9.将纯化柱置于新的1.5ml离心管中，加入60μl预热的ddH2O或ElutionBuffer。室温下放置2min后13000rpm离心1min，重复两次后，收集洗脱液。10.取少量产品加入BamH1限制性核算内切酶、×10缓冲液、水，酶切一段时间。11.测定得到的纯化产物的浓度，保存于-20℃冰箱中待用。4.3琼脂糖凝胶电泳A制胶（a）利用1×TAE溶液配制0.8%琼脂糖25ml(浓度由目的条带大小决定)，微波加热使之溶化；（b）加入2.5μLGoldView，轻轻摇匀，避免产生气泡；实验11朱奇2012011910（c）将制胶床放入水平放置的制胶托盘中，插好梳子，倒入融好的琼脂糖凝胶；（d）待凝胶充分凝固(30min)后，拔下梳子。B加样（e）将制胶床连同凝胶一起放入电泳槽中；（f）加入电泳缓冲液TAE，浸没胶面1mm左右；（g）10μL的样品和2μL点样缓冲液在封口膜上混和，然后点在点样孔中；（h）将4μL的DNAMarker点在点样孔中。C电泳（i）盖上透明上盖；（j）接通电源线，选择工作电压，120V，20min，打开电泳开关；（k）当加样缓冲液中的溴酚蓝迁移至足够分离DNA片段的距离时，关闭电源，将凝胶在紫外灯下观察，并用凝胶成像系统成像保存电泳图。（请注意观察，如溴酚蓝已经接近另一端时可及时停止）（l）如需要进行切胶回收，需要尽量保证目的DNA片段暴露在紫外灯下的时间比较短。五.实验结果分析1.提取质粒后获得的DNA浓度为：实验11朱奇2012011910测得pET提出的DNA浓度为39.1ng/μL,pUC提出的DNA浓度为66.1ng/μL。2.电泳根据电泳结果可以看出：未酶切的DNA与酶切DNA移动速度相近，亦即可以用未酶切DNA来鉴定DNA种类。通过作辅助线与标准MarkerIV相比较可知：pUC大致为3000bp，pET大致为5300bp。查得标准值为pUC19为2686bp,Pet28a为5369bp。本次实验结果与理论值相接近。从原图中可以看到，未酶切的DNA，电泳结果比较模糊，条带形状较差。这是因为未酶切的样品中大部分是超螺旋质粒，跑的最快，同时也存在少量其它形态的质粒，速度比较慢。而经过酶切后，几乎没有其它条带，而且与marker相对照也更为准确。实验11朱奇2012011910在实验过程中，加入BufferN1并离心后，上清中还残留有非常少量的白色沉淀。因为量非常少，因此也没有重复离心。在酶切的操作中，由于取用的量都是几微升，很难从枪头中打出来，混合的也不是很好。六.思考题1.溶液I、II和III中各成分在裂解过程中的作用是什么？答：溶液I：葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。Tris-Cl：缓冲液。EDTA：提供较低离子强度的环境。RNaseA：去除RNA。溶液II：NaOH：将pH提高至12以上，使细菌的大分子质量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。SDS：与染色体DNA和蛋白质形成沉淀。溶液III：乙酸钾和醋酸组成缓冲对，调节pH回中性，使变性的质粒DNA复性并能稳定存在。高盐的3mmol/L乙酸钾有利于变性的大分子染色体DNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀。2.沉淀法浓缩核酸可以采用的有机溶剂有哪些？试分析各种溶剂沉淀法的优缺点。答：有机溶剂能降低溶液的电解常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度的降低；另外，有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，故蛋白质在一定浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离的方法，称“有机溶剂分段沉淀法”。使用的有机溶剂多为乙醇、丙酮、异丙醇和甲醇等。各种溶剂沉淀法比较：1、金属离子沉淀法要求纯度高，且耗电量大；2、等电点法转置复杂，要求纯度也较高；3、盐析法的电解装置不易清洗；有机溶剂沉淀法成本较低，但毒性较大。3.所提取的质粒样品中可能含有那些物质？如何去除？答：在DNA的粗提液或其他的DNA反应体系中，一般都混有蛋白质、寡糖苷酸等杂质。酚和氯仿可以使蛋白质变性，离心后变性蛋白质存在于有机相和水相之间的界面，吸取上层含有DNA有水相，继续用氯仿抽提可以进一步使残留的蛋白质变性并去除水相中残留的酚。由此得到纯度较高的DNA水溶液，可以加盐和乙醇最后经高速离心得到DNA沉淀。4.质粒样品中含有的各种杂质在琼脂糖中的泳动速度次序如何？答：在DNA的粗提液或其他的DNA反应体系中，可能会混有寡糖苷酸等杂质。另外特殊硅基质吸附材料可以特异地吸附DNA，RNA则会穿过，被基本去除，而离心法在吸取水层时或多或少会吸取到下面的有机层，使得最后得到的物质中有RNA的存在。若质粒DNA样品在迁移率小的地方还有荧光条带，表明质粒DNA样品中有细菌的染色体DNA污染。泳动速度由大到小为：寡糖核苷酸RNA染色体DNA。5.超螺旋、开环和线性质粒的电泳速度次序如何？凝胶浓度对其有何影响？答：分子量相同时，不同构型DNA的迁移速度次序为：超螺旋质粒开环质粒线性质粒。线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大所受阻力越大，也越难于在凝胶空隙中蠕行，因而迁移得越慢。当琼脂糖浓度太高时，环状DNA不能进入胶中，相对迁移率为0，而同等大小的直线双链DNA则可以长轴方向前进。由此可见，这三种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度。实验11朱奇2012011910一个给定大小的线状DNA分子，其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性反比关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2~1.5%，分离大于10bk的DNA分子所需胶浓度为0.3~0.7%，DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8~1.0%。6.除琼脂糖凝胶电泳之外，质粒的分析鉴定方法还有哪些？试分析各种分析方法的优缺点。答：抗生素筛选：抗生素筛选操作简单；但是工作量大，并可能出现假阳性，也就是克隆片段并未连接到载体，可以用PCR来验证是否连接转化成功。基因测序：基因测序结果准确，但是设备较为昂贵。