小牛血去蛋白提取物中活性多肽的分离研究

小牛血去蛋白提取物中活性多肽的分离研究该论文主要论述了从脑代谢复活剂——小牛血去蛋白提取物注射液中分离纯化出其活性成分的过程.全文分为四个部分:第一部分建立了活性测定方法,对样品和每一步分离后的各组分进行活性筛选,并对样品的生化性质进行了分析.第二部分应用现代液相色谱方法,经过SuperdexPeptide凝胶色谱、C18反相色谱、C4反相色谱、Silica正相色谱、CN正相色谱,分离纯化出小牛血去蛋白提取物中的活性成分.第三部分采用高效液相色谱、高效毛细管电泳对活性成分进行了纯度及性质鉴定,表明为一活性肽,通过质谱分析确定了其分子量,Edman降解法测序确定了其氨基酸序列.第四部分为综述.综述Ⅰ报告了小牛血去蛋白提取物的主要药理作用、机制及其临床应用情况;综述Ⅱ从目前生物化学下游技术的角度,着重阐述了从复杂的混合物中分离纯化小分子量肽的方法。馆藏号：Y643075作者姓名：廖志湘学科专业：药物分析学导师姓名：徐康森学位级别：硕士学位授予单位：中国药品生物制品检定所学位年度：2000中图分类号：R284关键词：小牛血去蛋白提取物活性成分瓦氏呼吸仪测压法分离纯化中低压液相色谱高效液相色谱语种：中文文摘论文页数：1-58数据库名：中国学位论文文摘数据库复合酶法制取牛血血红蛋白水解液的工艺研究利用木瓜蛋白酶、复合蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、Protamex和Flavourzyme(风味蛋白酶)对牛血血红蛋白进行水解制备水解动物蛋白,以水解度(DH)为指标对水解过程进行分析,选取中性蛋白酶作为适宜的单酶并研究其酶法水解最适宜的工艺条件.为进一步提高水解度,进行了中性蛋白酶与Flavourzyme复合酶解的研究,并对双酶水解的工艺条件进行了优化,使水解率达到52.88%,比单酶水解时提高了55%.作者：周若兰王世平张永秀作者单位：中国农业大学食品科学与营养学院,北京,100083刊名：农业工程技术·农产品加工英文刊名：AGRICULTUREENGINEERINGTECHNOLOGY年,卷(期)：2006(05)栏目名称：加工技术分类号：TS2关键词：血红蛋白酶解水解度复合酶数据库名：数字化期刊数据库直接加热处理法生产牛血清白蛋白的工艺研究田荣华嘉庆易林姜悦笪旭辉林雯陈晓明四川师范大学学报2000Vol.23No.2P.163-165摘要：报道了一种直接加热制备牛血清白蛋白的新方法，该方法的白蛋白收率可达55%以上，纯度可达95%以上，是一种适合于大规模生产的工艺技术；主要研究了溶液pH值、加热温度、保温时间和稀释倍数等因素对白蛋白的收率和质量的影响.关键词：牛血清白蛋白；制备；加热处理分类号：Q512.1文献标识码：A文章编号：1001-8395(2000)02-0163-03AStudyonPreparationofBovineSerumAlbuminbyHeatTreatmentTIANRong-huaJIAQingYILinJIANGYueDAXu-huiLINWenCHENGXiao-ming(MianyangResearchCenterofBiotechnology,Mianyang621000,Sichuan)Abstract：Amethodforpreparingbovineserumalbumin(BSA)byheattreatmentisreported.TherecoveryyieldofBSAbythisprocedureismorethan55%andthepurityismorethan95%.TheeffectofpH,temperature,incubatingtimeanddilutionontherecoveryyieldandpurityofBSAisdescribed.Keywords：Bovineserumalbumin;Preparation;HeatTreatment0引言牛血清白蛋白是一种用途广泛的生化试剂，有关牛血清白蛋白的生产工艺和人血清白蛋白的生产工艺的研究报道较多，工艺也很成熟［1～3］，但牛血清白蛋白的生产多沿用人血清白蛋白的生产工艺，如低温乙醇法、利凡诺法和硫酸铵盐析法等，这些方法用于牛血清白蛋白的生产，有的因设备投入大，生产成本较高，或产品不易达到要求而缺乏竞争力，而我们利用直接加热法生产牛血清白蛋白，具有工艺简单，设备投资小，生产周期短，成本低等优点，是一种适于大规模生产的工艺技术.1材料与方法1.1牛血取自绵阳近郊屠宰场，以柠檬酸三钠为抗凝剂，血液采集后随即分离出血浆备用.1.2试剂牛血清白蛋白购自丽珠东风试剂公司；溴甲酚氯购自天津市化学试剂研究所；醋酸纤维素薄膜购自浙江曙光化工厂，其余试剂均为国产分析纯.1.3设备LG-6型大容量冷冻离心机(上海离心机研究所)，DF-C型电泳仪(北京东方仪器厂)，UV-754型紫外可见分光光度计(上海第三分析仪器厂)，PHS-2型酸度计(上海雷磁仪器厂).1.4白蛋白含量测定采用溴甲酚氯法，以牛血清白蛋白为标准［4］.1.5白蛋白纯度的测定采用醋酸纤维素薄膜电泳法.1.6吸光度值的测定用分光光度计直接测定蛋白质溶液在波长为403nm处的光吸收值，然后折算成浓度为10g/L时牛血清白蛋白的光吸收值，用A403表示.1.7白蛋白的生产工艺新鲜抗凝牛血用LC-6型大容量离心机(3000r/min×30min)离心分离出血浆，加一定量的蒸馏水稀释，再加入适当的稳定剂和蛋白沉淀剂，然后按下述方法进行实验处理：1.7.1不同pH值溶液对白蛋白的收率和质量的影响在其它条件固定的情况下，试验不同pH值对白蛋白的收率、纯度及A403值的影响.1.7.2不同加热保温时间对白蛋白的收率和质量的影响在选定的pH值和其它条件固定的情况下，试验不同加热保温时间对白蛋白的收率、纯度及A403值的影响.1.7.3不同稀释倍数对白蛋白的收率和质量的影响在选定的pH值和保温时间及其它条件固定的情况下，试验不同稀释倍数对白蛋白的收率、纯度及A403值的影响.1.7.4不同加热温度对白蛋白的收率和质量的影响在其它条件选定的情况下，试验不同加热温度对白蛋白的收率、纯度及A403值的影响.2结果2.1pH值对白蛋白的收率和质量的影响结果如图1所示.可见pH在5.0～5.4之间所得白蛋白的纯度最高，pH低于5.0或高于5.6白蛋白的纯度都有所降低;pH在5.2～5.6之间白蛋白的收率相近,但当pH值低于5.2时,收率降低,且越接近等电点,收率越低;在pH为5.2时A403值最低,色泽最好,当pH高于5.4以后,A403值迅速上升,所得白蛋白的色泽也迅速变差.图1pH值对工艺的影响2.2保温时间对白蛋白的收率和质量的影响结果如图2所示.可见随着保温时间的延长，白蛋白的收率略有降低，而纯度和A403值变化不大.说明保温时间对白蛋白的收率和质量影响较小.图2加热时间对工艺的影响2.3稀释倍数对白蛋白的收率和质量的影响结果如图3所示.可见，随着稀释倍数的增加，收率逐渐提高，而A403值在达到11稀释后变化不大.说明在我们所试验的范围内，稀释倍数对产品的纯度影响不大.图3不同稀释倍数对工艺的影响2.4加热温度对白蛋白的收率和质量的影响结果如图4所示.可见，随着温度的增加，白蛋白的收率呈下降趋势，而白蛋白的纯度以70℃时最高，增加或降低温度，白蛋白的纯度均略有下降，说明在65～75℃之间温度对A403值影响不大.图4加热温度对工艺的影响3讨论要生产高纯度(如纯度在99.5%以上)的牛血清白蛋白其工艺较复杂，而在分子生物学实验中又需大量的高纯度的牛血清白蛋白，这类产品国内生产较少，大多从国外供应，价格较高.我们所报道的方法是生产纯度不低于95%的牛血清白蛋白，专供生化试剂的需要，国内对这种生化试剂产品也有生产，大多应用硫酸铵盐析、低温乙醇法或利凡诺等方法，由于所消耗的原材料或生产过程较多，故成本较高，在市场上缺乏竞争力.我们选用直接加热法生产牛血清白蛋白，则工艺简单，生产周期短，原材料消耗少，重复性好，其纯度完全可以达到95%以上，其溶解度和色泽均达到生化试剂的要求，生产成本比其它方法低一倍左右，故有利于大规模生产.在研究的各种因素中，pH值的改变对白蛋白的收率，A403值影响较大，要同时使二者达到较好的结果，溶液pH的控制极为重要.在其它几个因素中，除稀释倍数对产品收率有一定的影响外，对白蛋白的质量和收率影响相对较小.由于牛血浆中含有高达50%的杂蛋白，因此，在加热变性的过程中有可能发生白蛋白与变性蛋白的共沉淀现象，从而影响收率.增加血浆的稀释倍数，降低蛋白质的浓度有助于提高白蛋白的收率，同时适度稀释，也可以使产品的色泽更好，但由于稀释倍数的提高会增加工作量和能源的消耗，因此，过度稀释不利于成本的降低.在试验过程中，我们采用的是自然过滤的方法，在沉淀中有一定量的残留液体，如果在生产中采用压滤等方式将这部分液体分离出来，可以使白蛋白的收率得到进一步提高.高质量的牛血清白蛋白应为白色或类白色的粉末，因此，色泽是白蛋白的质量指标之一，溶血或杂质残留过多均会引起白蛋白色泽变深.将A403值作为白蛋白生产中的控制指标，可以很好地监测产品的色泽，对工艺研究和生产过程中的质量控制均有重要的意义.(编辑余毅)■基金项目：绵阳市重点科技攻关资金资助项目作者简介：田荣华(1963-)，男，助理研究员作者单位：田荣华(绵阳生物工程研究中心，四川绵阳621000)嘉庆(绵阳生物工程研究中心，四川绵阳621000)易林(绵阳生物工程研究中心，四川绵阳621000)姜悦(绵阳生物工程研究中心，四川绵阳621000)笪旭辉(绵阳生物工程研究中心，四川绵阳621000)林雯(绵阳生物工程研究中心，四川绵阳621000)陈晓明(绵阳生物工程研究中心，四川绵阳621000)参考文献：［1］卢锦汉,章以浩,赵铠,主编.医学生物制品学［M］.北京：人民卫生出版社,1995.832.［2］罗亮，蔡骏，初毅.热变性和柱层析法结合生产人血白蛋白工艺的研究［J］.药物生物技术,1998,5(1):38～42.［3］郑秋君，胡忠玉，杨立清.应用层析法分离高纯度人血浆白蛋白［J］.中国生物制品学杂志,1995,8(2):60～62.［4］生物化学与生物化学检验技术编写组.生物化学与生物化学检验技术［M］.南京：江苏科学技术出版社,1985.203～205.收稿日期：1999-11-26