小麦抗旱基因TANAC69的重组分子的构建及筛选鉴定

小麦抗旱基因TANAC69的重组分子的构建及筛选鉴定1，获取目的基因(试剂盒法)（TRIZOL是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA，TRIZOL在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性）（1）样品处理：取50-100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置于1.5ml离心管中，加入1mlTrizol充分匀浆，室温静置5min。（2）加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min。（3）4℃离心，12000g×15min，取上清。（氯仿抽提蛋白，异丙醇沉淀RNA，乙醇洗涤）（4）加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。（5）4℃离心，12000g×10min，弃上清。（6）加入1ml75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g×5min，弃上清。（7）让沉淀的RNA在室温下自然干燥；（8）用Rnase-freewater溶解RNA沉淀。（不含水的RNA酶溶解RNA沉淀）2，设计引物（长度一般为16-30bp，最佳为20-24bp，两个引物间不应发生互补避免形成引物二聚体）目标序列中酶的识别位点，(用DNMAN找出目标序列中的酶的识别位点)AluI,AlwI,BssHII,CfoI,EcoRI,HaeIII,HhaI，HpaII，MboI,NarI，NcoI，NheI，PstIRsaISalI,Sau3A,SphI,StuI,TaqI,HindIIIAAGCTTBamHIGGATCC（在引物的5’端添加限制性内切酶的识别位点及保护碱基方便克隆）（先找出序列中的启动子ATG和终止子TAG）（特定的酶有特定的保护碱基）Up5’-CCCAAGCTTATGCAGTAGCCATCT-3’（CCC为保护碱基）（ATG启动子）（上游引物）Down5’-CGCGGATCCCTACACCAAGAATTC-3’（CGC为保护碱基）（TAG为终止子）（下游引物）（在进行PCR时需要确定具体参数，其中退火温度对扩增影响最大，而退火温度取决于引物的TM值，所以要确定ＴＭ值，退火温度掌握不好会发生非特异性结合，降低PCR产物的对模板的忠实程度）1gcagcatttttatgcagtagccatcttctcctcctcctccccccgccttccagctagcca61cctagctcactatcacatcatccagcagcccacaccaactcatattgattccgttcccac121ctgctcgccatcgccagccatgccaatgggcagcagcgccgccatgcccgccctccctcc181cggcttccggttccaccccaccgacgaggagctcatcgtccactacctccgcaggcaggc241cgcgtccatgcccagccccgtgcccatcatcgccgaggtcaacatctacaagtgcaaccc301atgggacctccccggcaaagctttgttcggggagaatgagtggtacttcttcagcccccg361ggatcgcaagtaccccaacggcgcgcgcccgaaccgcgccgccgggtccggctactggaa421ggccaccggcaccgacaaggccatcctgtccacgccggccaacgagagcatcggggtcaa481gaaggcgctcgtgttctacaggggcaagccgcccaagggcgtcaagaccgactggatcat541gcacgagtaccgcctcaccgcagccgacaaccggaccaccaagcgcagaggatcctccat601gaggctggatgactgggtgctgtgtaggatccacaagaagtgcggcaacttgcccaactt661ctcctcctctgaccaggaacaggagcatgagcaggagagctccaccgtggaggactcgca721gaacaaccacaccgtgtcgtcgcccaagtccgaggccttcgacggcgacggcgacgacca781cctccagttgcagcagttccgccccatggcgatcgccaagtcgtgctccctcaccgacct841gctcaacaccgtcgactacgccgcgctctcgcacctcctcctcgacggcgccggcgcctc901gtcgtcggacgccggagcagactaccagctgcctcccgaaaacccactcatctactcgca961gcctccatggcaacaaacgctacactataataacaacaacggctacgtgaacaacgagac1021catcgacgtgcctcagctacccgaggcgcgcgtagatgactacggcatgaatggcgataa1081gtataacggcatgaagaggaagagatccagcggcagcttgtactgcagccagctgcagct1141cccagcggatcagtacagcggcatgctgatccatccgttcctcagccagcagctgcacat1201gtgaagaaccagagagcttgggtcgaagagatcatcattgttccatttgaacttgctgta1261gatcgagaggatcccccgctgtggcagataggcagggatctagctagcttgctgtgtcgt1321gaacgaccgaccgataagaacggacaaatttcagaattcttggtgtagcacaaagctgta1381aattacgggggtttattgtgaaataaattaatccagtattatc3，RT-PCR扩增（RT—PCR，在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增）（1）cDNA的合成：逆转录体系的组成：ddH2O8ul（促进连接）dNTPs2.5ul（脱氧核糖核苷三磷酸，PCR中起原料作用）随机引物0.4ulRNasin0.5ul总RNA2.5－3ug70℃5min速置冰水中冷却再加：5×逆转录buffer5ul逆转录酶1ul加水至25ul37℃60min90℃5min（2）PCR扩增：20ulPCR体系的组成：ddH2O11ul10×TaqDNA聚合酶缓冲液2ulcDNA1ul正向引物1ul反向引物1uldNTPs1ulMgCl22ulTaqDNA聚合酶1ul总体积20ul混匀，置于PCR仪中进行自动PCR（3）PCR反应条件：（先看你两条引物的Tm值确定退火温度，再看引物的浓度，引物一般都有反应的终浓度。其次是酶的用量。延伸时间看你目的片段的大小）预变性94℃4min变性温度94℃1min退火温度48℃40s30次循环延伸温度72℃1min最后延伸72℃5min4，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物（1）琼脂糖凝胶的制备；琼脂糖凝胶浓度一般为0.5-1.5%，称取1g琼脂糖于250ml的三角瓶中，加入100ml0.5×TBE于微波炉加热煮沸，冷却至50℃以下，电泳平板洗净晾干，架上梳子后倒入凝胶5mm厚，待凝胶凝固后置于电泳槽中加入电泳缓冲液（在电泳液中科加入EB进行染色）至浸没胶0.5mm左右，拔出梳子，接上电源，明确电源极性。（2）样品准备；吸取重组的Ti质粒12ul，（Ti是在根瘤土壤杆菌细胞中存在的一种染色体外自主复制的环形双链DNA分子）加入4ul的重蒸水Buffer4ul进行点样（3）开稳压电源，电压调整至5V/cm，电泳3-4小时。（4）观察电泳结果。(条带清晰为好)5，DNA的回收与纯化进行琼脂糖电泳分析，从电泳后的凝胶中回收目的基因。此实验使用试剂盒法，将含有目的基因的凝胶切下来，使用凝胶熔化剂熔化凝胶，其次用结合液是DNA结合于DNA制备管的膜上，使用洗涤剂去除杂质，最后加入试剂将DNA从膜上洗脱且保存。6，构建克隆载体（PUC18和PUC19结构一样，都还有AMP抗性基因）从大肠杆菌中提取PUC18作为克隆载体（实验二；强碱法小量制备质粒DNA）将目的基因与PUC18进行双酶切，在DNA连接酶的作用下构建重组质粒7，将克隆载体转入受体菌，进行筛选（DH5α是最最常用的质粒克隆的菌株，DH5α在使用pUC系列质粒载体转化时,可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补.可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株.）(1)准备对数生长前期的E.coliInvaFDH5α，用预冷的CaCl2溶液制备感受态（感受态细胞（competentcell）：理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。CaCl法）(2)制作含有Amp的选择培养基，将重组质粒转入E.coliInvaFDH5α中并进行平板培养，筛选出重组子（实验一；大肠杆菌的对照培养）(3)使用蓝白斑筛选技术进行双重筛选(4)进行菌落PCR，扩增重组质粒(5)将重组质粒进行酶切反应(6)采用琼脂糖凝胶电泳进行检测（LacZ’是β—半乳糖苷酶的启动子+β半乳糖苷酶的氮端146个碱基酸的碱基。在进入受体细胞后，能够完整的表达LacZ’进行α-互补，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。没有切开，没有外源DNA插入的显蓝色，有重组质粒的细菌形成白色菌落）8，构建基因表达载体从含有重组子的受体菌中提取重组质粒选择人工构建的载体PBI121将重组质粒与PBI121进行双酶切构建基因表达载体（DNA连接酶）PBI121载体上含有HindIII与BamHI的酶识别位点，而且含有卡那霉素抗性标记基因，可以与目的基因进行重组与筛选9，基因表达载体转入大肠杆菌中进行筛选与保存PBI121载体上含有卡那霉素抗性标记基因，可进行筛选制作含有卡那霉素抗性标记基因的选择培养基，将重组的大肠杆菌进行平板培养，筛选出含有表达载体的大肠杆菌并保存（步骤类似于实验一）10，将带有目的基因的表达载体转移至根瘤农杆菌从大肠杆菌中提取基因表达载体（实验二）转移至根瘤农杆菌11，感染植株，进行重组制备外植体根瘤农杆菌感染外植体，带有目的基因的片段与植物细胞同源部分重组，得到含有小麦抗旱基因的外植体12，检测将重组后的外植体进行培养，然后用液体培养基洗去根瘤农杆菌诱导分化外植体，分化成苗提取植株中重组分子，进行检测双酶切重组分子，进行琼脂糖电泳分析