小鼠骨髓的综合性实验报告

本科学生综合性实验报告学号姓名学院专业、班级实验课程名称：教师及职称开课学期至学年学期填报时间年月日云南师范大学教务处编印一．实验设计方案实验序号实验名称实验时间实验室一、实验目的1、学习并掌握小鼠骨髓细胞染色体的制备方法。2、观察小鼠染色体的形态特征,统计细胞的染色体数目。3、了解微核发生的机制；4、掌握微核实验的一般程序和实践意义；5、掌握对实验动物进行药物处理的一般程序；6、掌握进行实验设计的一般程序和规则，并锻炼实践能力。二、实验原理、实验流程或装置示意图1、骨髓细胞具有高度的分裂增殖能力。因此可以直接得到中期细胞而不必象血淋巴细胞或组织那样要经过体外培养。经秋水仙素处理后，分裂增殖中的骨髓细胞由于纺缍体的形成受到抑制，染色体不能正常趋向两极而使之停留于中期，同时染色体缩短，轮廓清晰，把收获的细胞进行低渗，固定处理，使细胞处于膨胀状态，再将细胞悬液滴在载片上，使细胞破裂，染色体散开，染色后即可观察到染色体。2、微核（Micronucleus）：染色单体或染色体的无着丝点断片，或因纺锤体受损而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期，仍然遗留在细胞质中。末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，被包含在子细胞的胞质内，因比主核小，故称为微核。凡能使染色体发生断裂或使染色体和纺锤体联结损伤的化学物，都可用微核试验来检测。各种类型的骨髓细胞都可形成微核，但有核细胞的胞质少，微核与正常核叶及核的突起难以鉴别。嗜多染红细胞是分裂后期的红细胞由幼年发展为成熟红细胞的一个阶段，此时红细胞的主核已排出，因胞质内含有核糖体，姬姆萨染色呈灰蓝色，成熟红细胞的核糖体已消失，被染成淡桔红色。骨髓中嗜多染红细胞数量充足，微核容易辨认，而且微核自发率低，因此，骨髓中嗜多染红细胞成为微核试验的首选细胞群。三、实验设备及材料1、材料：小白鼠（2n=40）2、器具：注射器（1ml，5ml各一支）、托盘、解剖剪、镊子、吸管、离心管、离心机、载片、滤纸、白纱布小块等。3、药品：0.15mg/ml秋水仙素，1%柠檬酸三钠，固定液（3份甲醇，1份冰乙酸，临用时现配），Giemsa染液，2.2%柠檬酸钠，0.01M磷酸缓冲液（PBS）pH6.8。4、生物显微镜、解剖剪、镊子、注射器、载玻片、盖玻片、塑料吸瓶、吸水纸等。四、实验方法步骤及注意事项一、小鼠骨髓细胞染色体标本制备与观察1、处理：用1.5mg/kg秋水仙素腹腔注射处理小鼠（注射量为0.1ml/10g体重）。即用以上配制的秋水仙溶液按每10g体重注射0.1ml。注射后24小时，可以取骨2、处死：断颈法处死小鼠。剪刀剪开腿部的皮肤，用镊子夹住小鼠的股骨，剪去股骨周围的肌肉，将小鼠的两股骨取出，擦净股骨上的肌肉。去股骨的髋面，将吸有2.2%柠檬酸三钠溶液的小注射器的针头插入，反复几次吹出骨髓细胞，反复吹打直至股骨呈白色，制成细胞悬液。3、低渗：将细胞悬液在1000rpm/min离心5min，弃除上清液，留0.5ml摇匀。向细胞液中再加入1%的柠檬酸三钠溶液5ml用吸管轻吹打均匀，在室温低渗30min。低渗期间，配制固定液，即甲醇：冰醋酸为3:1（v/v)，置4℃冰箱中备用。4.预固定(1次)：低渗处理后的细胞悬液离心5分钟，留1ml原液，摇匀。加入新配制的固定液至6ml，吹打均匀，固定5分钟，再在1000rpm/min离心3-5min，去掉上清液。5、固定（2次）：沿离心管壁慢慢加入新配制的固定液6ml，用吸管轻轻吹打均匀，室温下固定5min，1000rpm/min3min，弃去上清；如此反复固定两次（共固定3次）。6.根据管底细胞量的多少，加入新配制的固定液0.3~0.8ml，用吸管打均匀，使其形成细胞悬液。7.滴片：将预冷的载玻片（0℃冰浴），水平或倾斜45°角放置，用吸管吸取细胞悬液，从约0.5-1m高处滴1~2滴到片子上，用口将其吹干，静置使其干燥。8.染色：将干燥的玻片放入2ml吉姆萨原液加入40ml磷酸缓冲液（pH6.8）配成的染液中染色20min，用磷酸缓冲液（pH6.8）冲洗，晾干后镜检。二、微核试验方法：1、骨髓的制取：断颈法处死小鼠。用剪刀剪开腿部的皮肤，用镊子夹住小鼠的股骨，剪去股骨周围的肌肉，将小鼠的两股骨取出，擦净股骨上的肌肉。去股骨的髋面，将吸有0.85%Nacl生理等渗液小注射器的针头插入，反复几次吹出骨髓细胞。反复吹打使其混合均匀，制成细胞悬液。将细胞悬液在1000转/分离心5分钟，弃除上清液。2、涂片：在离心管中加入少量的小牛血清（约0.3ml)混匀后，按血常规涂片法涂片，长度约2cm~3cm(涂片时一次涂成）。在空气中晾干。3、固定：将干燥的涂片放入甲醇液中固定5min。即使当日不染色，也应固定后保存。4、染色：将固定过的涂片放入Giemsa应用液中，染色20min~30min，然后立即用0.1mol/L磷酸盐缓冲液冲洗。5、封片：用滤纸及时擦干染片背面的水滴，再用双层滤纸轻轻按压染片，以吸附染片上残留的水分，再在空气中晃动数次，以促其尽快晾干，然后放入二甲苯中透明5min，取出滴上适量光学树脂胶，盖上盖玻片，写好标签。每只动物计数1000个嗜多染红细胞，观察含有微核的嗜多染红细胞数，微核率以千分率表示。数据处理：利用统计学软件SPSS的单因素方差分析或t检验等方法，进行数据处理，分析实验结果（如后表）。五、实验数据处理方法微核试验数据统计总表1：受试物剂量mg/Kg组别各受试小鼠1000个受检细胞中含微核细胞数12345678对苯二酚1201383335373435363080228313032292833274032025212328262422秋水仙素3136333234353131371.522925232624272524132421232019252219氯化汞312225202621232218221622211920181715131317151614151713阴性对照蒸馏水32143539阳性对照环磷酰胺40mg/kg体重3844454036414339表2对苯二酚对动物骨髓嗜多染红细胞微核发生率组别剂量动物数受检细胞数含微核细胞数微核率P值(g/kg体重)(只)(个)(个)(‰)受试物12088000对苯二酚80880004088000溶剂对照（蒸馏水）88000阳性物对照环磷酰胺(mg/kg体重)406．参考文献[1]孟紫强，阮爱东，桑楠等.SO2污染对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核的诱发作用.环境科学，2002，23（4）123-125.[2]孟紫强，桑楠，张波等.二氧化硫体内衍生物诱发小鼠骨髓嗜多染红细胞微核的效应.环境科学学报，2000，20（2）239-243.[3]耿德贵，王秀琴，刘士旺等.除草剂使它隆对黄鳝细胞的致突变作用研究.环境与健康杂志，2000，17（2）103-105.[4]周晓蓉，李百祥，邱向红等.小鼠骨髓及肝血中嗜多染红细胞微核率的比较.卫生毒理学杂志，1999，13（1）66-67.[5]曹佳.微核实验在中国的应用、发展与展望.遗传，2003，25（1）73-76.二．实验报告1．实验现象与结果2．对实验现象、实验结果的分析及其结论3．实验总结教师评语及评分：签名：年月日