山东单县鸡大肠杆菌病病原的分离与鉴定及药敏试验

1山东单县鸡大肠杆菌病病原的分离与鉴定及药敏试验王亚西南大学荣昌校区动物医学系，重庆荣昌402460摘要：鸡大肠杆菌感染是危害养鸡业的主要细菌性传染病，无菌采取单县各大鸡场中疑似大肠杆病死雏鸡肝、脾、肺等脏器病料，通过结合综合流行病学、临床学、病理学、生物化学和传染病学，进行分离与鉴定，最终确诊为鸡大肠杆菌病。从部分养鸡场分离出的细菌进行药敏试验，通过药敏试验筛选出敏感药物，为治疗与预防提供理论依据和实际应用参数。关键词：大肠杆菌；分离；鉴定；药敏试验TheSeparation,identificationandAntimicrobialSusceptibilityTestofChickenColibacillosisinShanxian,ShandongWANGYaDepartmentofVeterinaryMedicine,SouthwestUniversity,Chongqing,402460,ChinaAbstract:Chickencolibacillosisinfectionisthemajorinfectiousdiseasesinpoultryindustry.Sterilelyresortingtovisceralorgans,suchaslivers,spleens,lungsofillness,chicklingsthataresuspectedcolibacillosisofeachlargechickenplacesinShanxian,bythemeansofcombingwithepidemiology,clinical,pathology,biochemistryandepidemiology,wecanseparateandidentificatetodiagnosewhetheritiscolibacillosisornot.BythemeansofformdyeingandBiochemicaltestsandthenantimicrobialsusceptibilitytestonbacteriumthatisseparatedfrompartchickenplaces,wecanscreensomeSensitivedrugsandfindmoreeffectiveproprietarytoProvidetheoreticalbasisandpracticalparametersoftreatmentandprevention..Keywords:Colibacillosis；SeparationandIdentification；AntimicrobialSusceptibilityTest引言鸡大肠杆菌病是由大肠埃希氏杆菌(Escherichiacoli，E.coli)某些血清型菌株引起的一类疾病的总称[1]。大肠杆菌致病性菌株的致病因子主要由该病原体的三个特征所决定：侵袭力，感染力，致病性潜力。该菌主要有三个原类型，即菌体抗原，表面抗原，鞭毛抗原。该菌对外界的抵抗能力不强，一般60℃15min便可致死，对一般消毒药的抵抗力也很弱，但常用的消毒药水均能将其杀死[2]。2大肠杆菌病可以引起胚胎死亡、脐炎、败血症、肉肿、全眼球炎、气囊病、腹膜炎、输卵管炎等一系列病症，是家禽中最常见的病原菌之一[3]。由于该病在一些养殖场中严重发生，兽医临床上抗菌药物不得不大量地被应用，导致大肠杆菌耐药菌株不断出现，耐药谱不断扩大，形成恶性循环；同时加剧了抗菌药物在畜禽体内的残留，给养禽业的持续发展和人类的身体健康带来潜在危害[4]。随着单县养鸡业的迅速发展与高度集约化饲养，鸡大肠杆菌已成为鸡群中重要疾病之一。2010年9月，单县浮岗水库散养鸡舍所饲养的鸡于24天开始发病，两天之内，死亡21只。病鸡多精神沉郁，食欲减退，腹部膨大，粪便呈灰绿色或黄色，本实验室对单县送检的病鸡48只，病死鸡进行了剖检、病理学诊断和病原检测，确诊该鸡场发生了大肠杆菌病，筛选出对这些致病菌比较敏感的几种药物进行治疗，控制疫情。1材料1.1病料来源所有病料来自于单县六和饲料公司、华英禽业、浮岗水库等六大鸡场提供的病鸡，初步确诊为大肠杆菌病，病鸡48只，其中死亡35只，死亡鸡死亡时间不超过24h，其中肉仔鸡、蛋雏鸡27只，产蛋鸡21只。1.2仪器及设备光学显微镜、恒温箱、高压灭菌器、无菌实验台、微量移液器等（由山东省单县六和化验室提供）。1.3培养基与试剂麦康凯琼脂（NA）、伊红美兰琼脂、普通肉汤、营养琼脂（NA）验所用的培养基均参照《兽医微生物实验指导》制备。硝酸盐还原剂、氧化酶试剂、微量生化试验管（购于菏泽畜牧兽医学校）、药敏纸片购自单县畜牧兽医站(上海市医学化验所试剂厂生产)1.4试验动物。小白鼠（购于菏泽畜牧兽医学校）和各日龄健康鸡（购自浮岗水库分散养殖场）。2方法2.1病理剖检3对送检的35只病死鸡进行了病理剖检及大体病变的观察。2.2大肠杆菌的分离鉴定操作流程如下：样品↓在各种培养基上划线分离(置37℃培养24h)↓菌落形成↓—————————————————————↓↓↓挑取菌落染色镜检纯培养培养特性检查————————————————————————————↓↓↓↓染色镜检生化试验致病力测定药敏试验2.3病料采集采集六大鸡场病死鸡各一只，无菌取心脏和肝脏。注射器自心脏采血1ml用于细菌分离培养，用灭菌后的外科手术刀片烧烙脏被膜后，再用接种环刺入肝实质取肝样做分离培养。2.4分离培养以无菌操作的方法，将采取的病料，分别接种在普通琼脂平板、麦康凯琼脂、伊红美兰琼脂，37℃恒温培养24h，然后观察。挑取表面光滑、边缘整齐、灰白色、半透明的单个微隆起小菌落，划线接种于肉汤中，在37℃恒温培养24h[5]。2.5镜检挑取麦康凯琼脂平板上培养2Oh的新鲜菌落,光滑、砖红色的单个菌落涂片，将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染1min，水洗；滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗；滴加95%乙醇脱色约15～30s,直至染色液被洗掉，不要过分脱4色，水洗；滴加番红染液，复染1min，水洗、待干、镜检。结果：革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色[6]，观察记录菌体形态和染色特征。2.6生化鉴定a、糖发酵试验取可疑菌分别接种葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇和蔗糖发酵管，37℃培养2～3d，观察结果。b、MR试验和VP试验取可疑菌接种葡萄糖蛋白胨水，37℃培养2～3d，分别加入MR和VP指示剂，观察结果。c、吲哚试验取蛋白胨水培养管先加少量乙醚，塞紧棉塞振摇试管，使乙醚与培养液充分混匀，静置试管架上片刻，待乙醚浮于液面上层时，沿管壁加入吲哚试剂2～3滴，观察其颜色变化[7]。2.7致病性试验动物试验将分离菌接种于营养肉汤，于37℃恒温培养箱中培养24h。取健康小白鼠6只，分为A、B两组，A组3只，腹腔接种营养肉汤菌液，每只0.2mL；B组3只，腹腔接种等量的灭菌生理盐水作对照组，分别隔离饲养观察。取6只7日龄雏鸡，健康，也随机分为C、D两组，与小白鼠同样的方法，C组皮下接种营养肉汤菌液，每只0.2mL；D组接种等量的灭菌生理盐水，隔离饲养。2.8药敏试验药敏纸片购于单县畜牧兽医站(上海市医学化验所试剂厂生产)，选取不同地区的分离株6株进行药敏试验。在无菌条件下将培养24h的肉汤培养物，用灭菌生理盐水作10倍稀释，取0.2mL滴加在普通琼脂平板培养基上，用灭菌棒涂匀，平板置室温下干燥3～5min，用无菌镊子将卡那霉素、新霉素、庆大霉素、呋喃妥因、四环素、链霉素6种药物的含药纸片紧贴于琼脂表面，各纸片中心相距大于20mm，纸片距平板内缘大于15mm[8]；置35℃恒温箱内16～18h后，观察结果。3结果3.1病理剖检剖检时可闻到特殊臭味，见病鸡胸腔、腹腔内有大量黄色干酪样渗出物腹腔内大块黄色块状渗出物；肝脏肿大，表面瘀血，有散在的白色小坏死灶；纤维性心包炎，心包浑浊增厚，心包腔内充满大量淡黄色液体，心包膜及心外膜上有白5色纤维蛋白附着，严重者可见心包膜与心外膜粘连；肺脏瘀血，表面的纤维性渗出物明显；肠黏膜弥漫性出血，整个肠管呈紫红色；肾脏体积肿大，呈紫红色，肾脏出血，水肿，质脆，一触即烂。3.2大肠杆菌的分离培养麦康凯琼脂上形成红色、圆形隆起、光滑湿润、边缘整齐、直径为1.5～2.5毫米的小菌落（见图1）；在伊红美蓝琼脂上形成紫黑色、具有金属光泽的小菌落（见图2）；在普通琼脂斜面上的菌落为灰白色；在普通肉汤中呈均匀浑浊，管底有灰白色沉淀，并有粪臭味。图1麦康凯琼脂Figure1MaiKangKaiagar图2伊红美蓝琼脂Figure2Eosinmethyleneblueagar3.3形态学观察经镜检可见到革兰氏阴性菌，两端钝圆，有长约1.5～3.O微米的短小杆菌，6偶有2～3个菌体相连，无芽孢。（见图3）图3镜检结果Figure3Microscopyresult3.4生化鉴定将分离到的菌株，经生化试验鉴定，分解葡萄糖、麦芽糖、甘露醇产酸产气，不分解蔗糖,MR试验呈阳性，VP试验为阴性，吲哚试验阳性,硝酸盐试验阳性，枸橼酸盐试验阴性，硫化氰试验阴性。此结果符合大肠杆菌的特征，见表1：表1分离菌生化试验结果Table1Thebiochemicaltestresultsofseparatingbacteria生化试剂生化试剂乳糖⊕构椽酸盐—葡萄糖⊕VP试验—甘露醇⊕靛基质+麦芽糖⊕MR试验+蔗糖—硫化氢—阿拉伯糖—尿素酶—山梨醇—吲哚+硝酸盐+注：+表不阳性；一表不阴性；○+表不阳性并产气[9]。3.5致病性实验7小白鼠试验结果：接种36h内A组小白鼠全部死亡，剖检可见肝肿大、表现出点状出血和灰白色坏死灶，脾脏瘀血，肺脏出血等明显病理变化，从死亡小白鼠的心、肝、脾等病料中均能回收到接种菌；B组小白鼠饲养1周后全部存活，剖检无病理变化。雏鸡试验结果：接种1周后，C组雏鸡全部死亡，用死鸡的心血、肝、脾接种于普通营养琼脂培养基上，经37℃培养24h后，有菌落生长，革兰氏染色及生化化鉴定表明：此菌与接种菌为同种细菌；D组雏鸡则正常。动物试验结果表明：此次分离出的细菌对小白鼠和雏鸡均有较强的致病性。3.6药敏试验卡那霉素、新霉素、庆大霉素等药物为高度敏感；呋喃妥因、四环素等药物为中度敏感；链霉素不敏感；见表2：表2耐药性实验结果统计Table2Thestatisticsofresistanceexperimentresults*[抑菌圈直径15.1～20毫米者为高度敏感；直径10.1～15毫米者为中度敏感；直径在l0毫米以下者为耐药[10]。4讨论与分析大肠杆菌是革兰氏阴性菌，染色均一，有周身鞭毛，致病性大肠杆菌还能产生毒素。大肠杆菌有3种抗原：菌体抗原(O－Ag)、荚膜抗原(K－Ag)和鞭毛抗原(H－Ag)，这3种抗原形成了众多的血清型[11]。高崧[12]等关于禽致病性大肠杆菌的流行病学调查表明，禽病原性大肠杆菌的优势血清型与时间、地区及实地状况药敏纸片抑菌圈直径／mm1号菌株2号菌株3号菌株4号菌株5号菌株6号菌株呋喃妥因109111098卡那霉素222020172121庆大霉素181919202019四环素131012101114新霉素222123202021链霉素7997878密切相关。因此，开展特定地区鸡大肠杆菌的流行病学调查成为大肠杆菌病防治的重要基础。在生产当中用药不规范，疗程不当，用量不足，长期使用同一类药物或长期在饲料、饮水中加入预防性用药，均可使细菌产生抗药性。为防止细菌产生耐药性，应采取以下措施：严格掌握适应性；避免滥用抗菌药；确定有效的剂量和疗程；严格遵守抗菌药物局部使用、预防应用、饲料添加及联合使用的相关原则；有效地分期交替使用抗菌药；根据细菌耐药机制和抗菌药结构的关系，寻找和研制出新的尤其对耐药菌有抗菌活性的抗菌药。大肠杆菌是一种条件性致病病原微生物，它广泛存在于饲料、垫草、粪污和禽舍的灰尘中，也作为常在菌，存在于正常动物的肠道中，当机体抵抗力下降，特别是应激情况下，细菌的致病性即可表现出来，使感染的鸡发病。因此，