大肠杆菌稳定性的控制方法

1.常用的长期保存法有：液体石蜡法、硅胶保存法、加入甘油或二甲基亚砜（DMSD）等保护剂。2.甘油低温保存法(－70℃—－196℃)的特点甘油菌低温保存的基本原理是：在-70℃或液氮中冻存，细菌内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。在0℃—-70℃温度范围内，水晶呈针状，极易招致细菌的严重损伤。用电镜观察，可见细菌的核膜上有大量针尖样小孔。因此，为了避免0℃-70℃冰晶的形成和细菌膜两侧离子平衡的破坏，需要加保护剂。甘油可降低冰点，在缓慢的冻结条件下，能使细菌内水分在冻结前透出细菌外。贮存在-70℃以下低温中能减少冰晶形成，甘油对细菌无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细菌.使用浓度范围为15%-50%，一般常用30%。在保存瓶中按1：1加入60%的甘油和菌液，混匀后贮存于-70℃或液氮中。复苏后细菌仍能生长，活力不受任何影响。二、菌种的复苏：复苏菌种时，用接种环或牙签挑取少许冻结的菌种到平皿上，37℃培养8-12小时即可。甘油菌从冰箱取出使用时应置于低温或0℃冰浴中，用完尽快放回，接种时挑取表面已融化部分即可，不可全溶，因反复冻融会导致细胞壁破裂。切记：接种过程中不得使保存瓶中的菌液融化。3.除了上面的办法，还可以穿刺培养，就是在EP管中倒上固体培养基，然后用接种针插入固体培养基中进行接种，在4度可保存1年左右。4.液体菌体可以用DMSO二甲基砜（不过这东西有毒！）—20C°可以保存2到3年。想复苏你的大肠杆菌的话，可以涂布法去除甘油或者DMSO，平板涂布法比划线法要好一点.5.保菌的话摇菌使其到OD差不多0.6左右保，不要放过夜，会影响菌的活性。一管一毫升的菌液，瞬离去掉上清，沉淀用700微升LB悬起来，再加入300微升的甘油，混匀就可以了。一般先放到-20，一天后就可以放到-80了。一般存放一年没有问题。6.影响微生物真空冷冻干燥后存活率的原因主要有两方面，一方面是微生物自身，另一方面是冷冻、干燥、贮藏微生物的环境条件。按保护剂的化学结构大体可将保护剂分为三类:糖类保护剂、蛋白类保护剂、其他。糖类和蛋白质是相关研究中应用最广泛的两类保护剂，是研究人员选择保护剂首要考虑的对象［8］。糖类保护剂主要包括单糖、二糖、三糖。单糖中最常用的保护剂有:葡萄糖、果糖、半乳糖。二糖中最常用的保护剂有:海藻糖、蔗糖、乳糖。三糖中最常用的保护剂是棉籽糖。有研究表明单糖中半乳糖保护效果最好，三糖中棉籽糖对细菌的保护作用较好［9－10］，二糖的保护效果普遍较好［11－13］，Costa等对成团泛菌(Pantoeaagglomerans)进行研究，得出最佳的保护剂是海藻糖和蔗糖，当使用5g/100mL的海藻糖时，其存活率达到83%左右，当使用10g/100mL的蔗糖时，存活率达到75%左右［14］。糖类保护性能的不同源于它们与水结合能力和抑制细胞内外冰晶形成的差异［15］，与是否能够参与代谢没有多大关系［16］。有研究表明二糖比三糖应用广泛是因为二糖比三糖对磷脂膜有更强的结合力［17］。蛋白类保护剂主要包括牛乳蛋白、血清、大豆蛋白、胶原蛋白等，有研究表明蛋白质比糖类有更高的玻璃化转变温度，在冷冻干燥形成玻璃态方面，蛋白质比糖类扮演更重要的角色［1］，此外蛋白质可在微生物细胞壁外形成保护性外膜［9］。0.1～4g/100mL的血清白蛋白很长时间被作为病毒和立克次体的冻干保护剂［18］。有研究表明，2g/100mL的类人胶原蛋白可使长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)存活率达到39.09%±1.27%［19］。Wang等以发酵豆奶作为保护剂可使长双歧杆菌(B.longumB6)的存活率达到43%～52%［20］具有强水化作用的物质在微生物冷冻时均有很好的保护效果。保护剂分子能取代水分子的作用,维持生物分子的结构和功能不受损伤。海藻糖被认为是非常有效的冷冻干燥保护剂，有些微生物在缓慢干燥时会自身合成海藻糖以达到存活的目的[13]。以海藻糖为例,微生物在冻干之前加入海藻糖,海藻糖与生物膜的磷酸盐羟基之间形成氢键,这样微生物冻干时,水化层虽然消失,但生物膜仍然保存着一层海藻糖,从而有效地防止生物膜间的融合,海藻糖与极性头基形成氢键,还降低碳氢链堆积密度,减弱碳氢链之间的范德华力,导致干燥磷脂双层相转变温度降低,使干燥膜即使在常温下也处于液晶态,这样微生物在干燥和复水两个阶段均不发生相转变和膜内容物的泄漏