大肠菌群不确定度

食品中大肠菌群平板计数结果不确定度的评定摘要：依据国家标准和测量不确定度的评定方法以及国际通行的普松理论（ｐｏｉｓｓｏｎｔｈｅｏｒｙ），评定食品中大肠菌群检测结果的不确定度。通过分析影响食品中大肠菌群平板计数结果的不确定度来源，建立一种简适用的大肠菌群平板计数不确定度评定方法。结果表明，影响食品中大肠菌群平板计数结果不确定度的主要因素为取样量的不确定度、稀释倍数的不确定度、加样体积的不确定度、平板上大肠菌群数量的不确定度和煌绿乳糖胆盐（ＢＧＬＢ）肉汤管产气比例产生的不确定度，其中后两者产生的不确定度所占分量最大。１检验方法依据《ＧＢ／Ｔ４７８９．３———２０１０食品卫生微生物学检验大肠菌群计数》［３］中第二法平板计数法进行检验。流程如下：２５ｇ样品＋２２５ｍＬ磷酸盐缓冲溶液→１０倍系列稀释→结晶紫中性红胆盐琼脂（ＶＲＢＡ）平板→（３６±１）℃培养１８～２４→计数→挑选典型和可疑菌落→ＢＧＬＢ肉汤管→（３６±１）℃培养４～４８ｈ→计数产气情况→报告大肠菌群检验计数结果。２不确定度分量的主要来源检验结果的不确定度来源见图１３各不确定度分量的评定３．１样品制备称量过程中引入的不确定度（Ａ类）在无菌条件下将样品充分混匀后随机取样，可认为样品是均匀的、代表性充分；均质袋拍击速度和拍击时间严格按照该标准［１］规定执行，则此处忽略不确定度。称量样品质量时采用精度为０．１ｇ的电子天平称取２５．０ｇ样品，并用５００ｍＬ量出式量筒量取２２５ｍＬ缓冲液制成１∶１０的样品匀液，根据电子天平检定证书给出的最大允许误差（ＭＰＥ）为０．１ｇ，量筒按ＪＪＧ１９６———２００６常用玻璃量器［６］的容量允差为±５ｍＬ，由于按级使用的数字式仪表、测量仪器最大允许误差导致的不确定度属于矩形（均匀）分布［４］，则天平和玻璃容器的标准不确定度μ（ｍ样）和μ（ｖ样）分别为：相应地它们的相对标准不确定度Ｕｒｅｌ（ｍ样）和Ｕｒｅｌ（ｖ样）分别为：则该步产生的相对标准不确定度Ｕｒｅｌ（取样）根据式（１）计算：３．２样品稀释过程中引入的不确定度（Ａ类）样品１０倍系列梯度稀释采用１ｍＬ移液器和１０ｍＬ量出式分度吸管进行。ＪＪＧ６４６———２００６移液器检定规程［７］规定１０００μＬ可调移液器吸取１ｍＬ时容量允差为±１．０％，ＪＪＧ１９６———２００６常用玻璃量器［５］规定，２０℃时１０ｍＬ分度吸管（Ａ级）的容量允差为±０．０５ｍＬ，取矩形分布，则它们的标准不确定度μ（Ｖ移液器）和μ（Ｖ吸管）分别为：相应地它们的相对标准不确定度Ｕｒｅｌ（Ｖ移液器）和Ｕｒｅｌ（Ｖ吸管）分别为：则该步产生的相对标准不确定度Ｕｒｅｌ（稀释），可根据普松关于微生物培养产生的不确定度定量测定理论中的公式（式（２））［５］计算：Ｕｒｅｌ（Ｖ移液器）———Ｖ移液器的相对标准不确定度；Ｕｒｅｌ（Ｖ吸管）———Ｖ吸管的相对标准不确定度。则：样品的多步稀释方法相同，则Ｕ２ｒｅｌ（总稀释）＝ｋ×Ｕ２ｒｅｌ（稀释）［５］，ｋ为１０倍系列梯度稀释次数，若第一次取１ｍＬ样液到９ｍＬ稀释液中相当于稀释１０倍，则ｋ为１，依次类推。本试验为稀释１０倍的平板计数结果，则ｋ为１，则Ｕｒｅｌ（总稀释）＝本试验在２０℃标准温度的环境中进行，因此，忽略溶液温度与校准时温度不同引起的不确定度。若溶液温度不为标准温度时，则必须考虑温度对量器体积的影响［６－７］。３．３样品加样体积的相对标准不确定度（Ａ类）分别用１ｍＬ移液器取１ｍＬ稀释液接种于两个无菌培养基中培养，其产生的Ｕｒｅｌ（Ｖ加样）＝Ｕｒｅｌ（Ｖ移液器）即为０．００５７７。４结果与讨论影响大肠菌群平板菌落计数结果不确定度的因素很多，在其整个检测过程中除了上述不确定度之外，还有样品保存条件、检测环境、培养基质量、培养条件（温度、湿度）、培养时间、人员计数以及数值修约等方面引起的不确定度［９］。本试验主要以相同人员在同一检验环境中严格按照检验标准要求进行一次检验所得结果进行的不确定度分析评定，主要分析样品取样、样品稀释、样品加样体积、平板菌落数以及ＢＧＬＢ肉汤管产气比例对测量不确定度的影响，忽略了环境因素和人为因素的影响，故其它不确定度未计算在内。本试验采用ＧＢ／Ｔ４７８９．３———２０１０中的第二法（大肠菌群平板计算法），由于大肠菌群平板计数的菌落数均值为１１９ＣＦＵ，菌落总稀释度为１０２，ＢＧＬＢ肉汤管产气比例为９８％，按照实际检测只从平板上挑选１０个菌落进行验证，则产阳性菌株近似为１００％，其不确定度已另外计算出。检测结的扩展不确定度为２４ＣＦＵ，则大肠菌群平板菌落计数检测结果为：（１１９００±２４）ＣＦＵ／ｇ，包含因子ｋ≈２。通过对各不确定度分量进行分析和计算表明，样品平板大肠菌群数量产生的不确定度和ＢＧＬＢ肉汤管产气比例产生的不确定度所占分量最大。通过选择合适的、可行的试验方案，规范操作就可以减小关键步骤的不确定度分量值，保证检验结果的准确、可靠。该方法可以广泛应用于各类食品中大肠菌群平板计数不确定度的评定。