如何克隆哺乳动物免疫基因的上游区启动子

分子生物学论文如何克隆哺乳动物免疫基因的上游区启动子，并验证其中的调控元件？实验原因：随着气候变化，环境污染，水污染，放射性污染，重金属污染，生态系统遭到破坏，在这个疾病泛滥的时代，我们每个人、哺乳动物都不能避免生病这件事情，而对于某些恶性疾病，对我们来说是致命的，如果我们能够掌握免疫启动上的技术，那么我们就可以按照我们的意愿及时对免疫基因的启动子进行调控，使得我们可以及时预防恶性疾病的侵袭，避免一定的经济损失，在体内合成大量的抗体，当病毒分子来袭时我们可以做好准备工作，对于养殖业来说可以大大降低生产时候药物资金的投入，同时使得我们的供应品更让人放心，同时对于人类来说，减少疾病的折磨，人和动物传染病、寄生虫病、肿瘤、自身免疫病和变态反应性疾病进行诊断，是免疫技术最突出的应用。尤其是酶标抗体技术，已成为多种传染病的常规诊断方法，如已有人各型肝炎、猪瘟等ELISA试剂盒，它们简便、快速，又具有高度的敏感性和可重复性。此外，免疫基因在疾病诊断、动物生理活动研究、物种及微生物鉴定、动物性状的免疫标记等方面有极其重要的应用，所以对哺乳动物免疫基因上游区启动子的研究是很有必要很有意义的一件事情。实验方法：启动子（promoter）是基因的一个组成部分，在遗传学中是指一段能使基因进行转录的脱氧核糖核酸（DNA）序列。启动子可以被RNA聚合酶辨认，并开始转录。在核糖核酸（RNA）合成中，启动子可以和决定转录的开始的转录因子产成相互作用，控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度，包含核心启动子区域和调控区域,就像“开关”，决定基因的活动，继而控制细胞开始生产哪一种蛋白质。完全的启动子称为规范序列。在真核生物基因中，Hogness等先在珠蛋白基因中发现了类似Pribrow区的Hogness区（Hognessbox），这是位于转录起始点上游-25~-30bp处的共同序列似TAAA，也称为TATA区。另外，在起始位点上游-70～-78bp处还育另一段共同序列CCAAT，这是与原核生物中-35bp区相对应的序列．称为CAAT区（CAAThox）。在真核基因中，有少数基因没有TATA框。没有TATA框的真核基因启动子序列中，有的富集GC，即有GC框；有的则没有GC框。GC框位于-80～-110bp处的GCCACACCC或GGGCGGG序列。TATA框的主要作用是使转录精确地起始；CAAT框和GC框则主要是控制转录起始的频率，特别是CAAT框对转录起始频率的作用更大。如在TATA框同相邻的UPE之间插入核苷酸，也会影响转录使之减弱。TATA框上游的保守序列称为上游启动子元件(upstreampromoterelement，UPE）或上游激活序列。-10序列又称为Pribnow盒（原核生物）。在真核生物中相应的序列位于-35bp处，称为TATA盒，又称为Goldberg-Hognessbox，是RNA聚合酶Ⅱ的结合部位。-10和-35这两个部位都很重要。上游控制元件从-180bp至-107bp，上游启动子有3个上游元件：TATA框，近端序列元件（PSE）h和八聚体元件（OCT）。上游序列往往有另外的功能。例如上游顺序可以吸引拓扑异构酶，后者可导致结合的局部产生有利于转录起始的超螺旋状态。上游顺序所引起的DNA结构的微细变化可能在双螺旋上被传导到相当远的距离，因此上游顺序的变化可以影响到-10和-35区的DNA结构细节。启动子研究的第一步是确定启动子的位置及长度，主要方法是用却是实验来确定启动子上游的边界，当缺失影响转录起始时，说明该处就是启动子上游区的边界，SmartRace技术是近年来开发的一种快速、方便的定位基因转录起始位点的方法。启动子克隆方法：利用启动子探针质粒载体筛选启动子；启动子探针型载体是一种经济、有效、快速分离基因启动子的工具型载体，包括两个部分：转化单元和检测单元。其中，转化单元含复制起点和抗生素抗性基因，用于选择被转化的细胞；检测单元则包括1个已失去转录功能且易于检测的遗传标记基因以及克隆位点。利用启动子探针筛选启动子过程：先选用一种适当的限制性核酸内切酶消化切割染色体DNA，然后将切割产生的DNA限制片段群体与无启动子的探针质粒载体重组，并按照设计要求是克隆片段恰好插在紧邻报告基因的上游位置；随后再把重组或何物转化给寄主细胞，构建质粒载体基因文库，并检测报告基因的表达活性。当插入段同时满足（1）具有基因启动子序列（2）具有翻译起始区（3）具有起始密码子（4）插入方向正确（5）插入片段3’端编码区序列抗性基因融合基因，从而启动抗性基因表达。启动子区域的确定——染色体定位，根据基因图谱对序列进行染色体定位浏览其基因组上游基因，具体方法（1）进行GenomicBLAST搜索；（2）通过Genomeview观察基因组结构；（3）点击相应染色体区域上游的基因进行精确定位实验结果：基因上游调控序列的分析:(1)启动子预测，用FIRSTEF程序进行启动子预测，用PT-PCR等实验方法，获得的mRNA往往缺少完整的5’端，采用FirstEF程序可以对第一外显子和CPG相关启动子进行预测。(2)转录因子结合位点分析：TFSEARCH程序和MATCH程序。报告基因是一种编码可检测的蛋白质或酶的基因，可以通过对其表达产物的鉴定及定量分析等进而对目的基因进行研究，报告基因主要用于：1.把报告基因序列和起基因表达调控作用的序列连接起来，进行表达调控序列的结构和功能研究2、与目的基因融合表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达3、在反式作用因子相互作用检测体系中，可通过报告基因的表达，研究蛋白质与蛋白质只见到相互作用。另外，在基因工程中常用报告基因里对转化条件进行摸索和优化功能研究。作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件1、已被克隆且序列清楚2、表达产物受体细胞不存在3、表达产物能进行定量测定，在动物基因表达调控中，报告基因被广泛应用。将所研究的目的基因调控序列克隆到报告基因的表达质粒中，然后将重组质粒导入适当细胞系，通过测定报告基因的表达的水平，间接评价，在调控序列指导下对基因表达的作用。