宁二笑_1030050124_姜酚与姜烯酚对胰蛋白酶活性抑制效果的研究

山西师范大学本科毕业论文姜酚与姜烯酚对胰蛋白酶活性抑制效果的研究姓名宁二笑院系工程学院专业食品营养与检验教育班级10300501学号1030050124指导教师郭京波答辩日期成绩姜酚与姜烯酚对胰蛋白酶活性抑制效果的研究内容摘要姜酚与姜稀酚作为生姜中的重要活性物质，具有很多功效，探究他们对胰蛋白酶活性的抑制作用，可进一步扩大生姜的药用价值。本实验以BAPNA为底物，以6-、8-、10-姜酚及6-、8-、10-姜烯酚为抑制剂，在37℃的环境下，研究其对胰蛋白酶活性抑制效果。10min后，迅速加入33%的醋酸溶液终止反应，通过测定各反应体系在A410处的吸光值，来对比六种抑制剂对胰蛋白酶活性的抑制作用。结果表明，6-、8-、10-姜酚及6-、8-、10-姜烯酚六种抑制剂对胰蛋白酶活性的抑制作用大小顺序依次为：6-姜烯酚〉6-姜酚〉8-姜稀酚〉10-姜稀酚〉8-姜酚〉10-姜酚。【关键词】姜酚姜烯酚胰蛋白酶抑制率StudyontheinhibitoryeffectofgingerolandshogaoontheactivityoftrypsinAbstractAstheimportantactivesubstancesofginger,gingerolandshogaolhavemanyeffects.Exploreingtheirinhibitiontotrypsinactivitycanbefurtherexpandedgingermedicinalvalue.Inthisexperiment,BAPNAassubstrate,6-,8-,10-gingeroland6-,8-,10–shogaoasinhibitor,tostudytheinhibitoryeffectontheactivityoftrypsinat37℃.After10min,addedrapidly33%aceticacidsolutiontoterminatethereaction,thereactionsystemwasmeasuredbyabsorbanceatA410tocomparetheinhibitoryeffectofsixinhibitorstotheactivityoftrypsin.Theresultsshowedthattheorderoftheinhibitionofthesixtrypsinactivityinhibitorsis:6-shogao6-gingerol8-shogao10-shogao8-gingerol10-gingerol【KeyWords】gingerolshogaotrypsinInhibitionrate目录前言..............................................................11试验材料及仪器设备.........................................11.1试剂........................................................11.2主要仪器与设备..............................................12.试验方法......................................................22.1各溶液的配制..................................................22.2姜酚和姜稀酚对胰蛋白酶活性抑制的测定..........................23.结果与分析...................................................23.16-姜酚的抑制效果的分析........................................23.28-姜酚的抑制效果的分析........................................33.310-姜酚的抑制效果的分析.......................................33.46-姜烯酚的抑制效果的分析......................................43.58-姜烯酚的抑制效果的分析......................................43.610-姜烯酚的抑制效果的分析.....................................54.结论...........................................................6参考文献.........................................................6致谢..............................................................81姜酚与姜烯酚对胰蛋白酶活性抑制效果的研究学生姓名：宁二笑指导老师：郭京波前言生姜，别称姜、姜根，英文名ZingiberofficinaleRoscoe，是一种常见的调味植物，也是迄今为止国际贸易根茎类香料中最为重要的一种，它的种植范围很广，我国南部及中部地区都大批栽植。另外，生姜还是一种传统的即可食用，也可药用的植物[1]，具有保护胃黏膜、保胆利肝、升血压、强心、降低血脂、消除炎症、止咳、抗呕吐、防眩晕、对中枢神经抑制对癌症放化疗减毒等多种功效[2-5]。生姜中的生物活性物质有很多种，如姜稀酚(shogao)与姜酚(gingerol)[6]，在姜的处理保存过程中，姜酚容易分解成姜烯酚[7-8]，使生姜的价值也有了一定的改变。正常生理条件下胰蛋白酶(trypsin)在血液中的含量非常低,但是胰腺炎、肺气肿、癌症及各种脑血管等疾病患者体内存在过量的胰蛋白酶,由于胰蛋白酶是一种触发酶,这些疾病与胰蛋白酶有着密切的关系[9]，医学上发现,胰蛋白酶也与肿瘤细胞的浸润和转移过程有关,并易导致肿瘤恶化。现代医学治疗此类疾病的方法大多是运用蛋白质类胰蛋白酶抑制剂进行控制,治疗后多有反弹或副作用,并不宜作为长期预防之用。迄今为止，仍未见有关于生姜中姜酚与姜稀酚对胰蛋白酶活性抑制作用的研究报道[11]，因此，利用BAPNA法[10]探讨生姜中活性成分6、8、10-gingerol与6、8、10-shogao对胰蛋白酶活性的抑制作用，对于深入阐明其抑制机理，开发新型的抑制剂、保健产品，以及胰蛋白酶过多患者的日常调理等都具有重要的理论与实践意义。1试验材料及仪器设备1.1试剂(均为分析纯）1.2主要仪器与设备FA-04电子天平上海天达仪器有限公司6-、8-、10-姜酚及6-、8-、10-姜烯酚上海金穗生物科技有限公司胰蛋白酶上海蓝季科技发展有限公司三羟甲基氨基甲烷（Tris）天津市科密欧化学试剂有限公司Na-苯甲酰-DL-精氨酸-对硝基酰胺盐酸盐山海丽臣商贸有限公司二甲基亚砜（DMSO）西安聚信化工有限公司盐酸洛阳化学试剂厂冰醋酸天津市科密欧化学试剂有限公司甲醇天津市科密欧化学试剂有限公司异丙醇天津市科密欧化学试剂有限公司22.试验方法2.1溶液的配制2.1.1胰蛋白酶储存液配制准确称取6mg胰蛋白酶，溶解于10mLTris.Cl缓存液（pH为7.4）中，得到0.001mmol/L的胰蛋白酶溶液，在-20℃下密封保存备用[12]。2.1.2底物溶液的配制准确称取13mgBAPNA溶液，溶解于1mL二甲基亚砜中，得到所需的底物溶液，此溶液须现配现用。2.1.3抑制剂溶液的配制准确称取一定量6-、8-、10-姜烯酚或6-、8-、10-姜酚，分别溶于甲醇中，定容。各设定以下5个摩尔浓度：0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L、0.5mol/L[13]。2.2姜酚和姜稀酚对胰蛋白酶活性抑制的测定取一支10ml具塞管，保证干燥、洁净，然后按照以下次序依次向内加入1mLTris·Cl溶液、0.3mLBAPNA溶液、0.3mL的0.1mol/L的6-姜酚溶液，用缓冲液补加到2mL，为达到适宜反应的37℃的温度，将反映体系维持10min于恒温锅中。接着加入0.3mL的37℃trypsin溶液，恒温反应10min，期间不断摇晃，使体系得以反应充分。计时结束后，立刻加入0.3mL的33%醋酸溶液停止反应，最后用1cm吸收皿，在410nm处测吸光值A1[14-16]。其他浓度下的该溶液的抑制效果的测定同上。不同浓度下其他抑制剂的效果的测定同6-姜酚溶液。取一支10mL具塞管，保证干燥、洁净，然后按照以下次序依次向内加入1mLTris·Cl溶液、0.3mLBAPNA溶液以及同体积的甲醇溶液，用缓冲液补加到2mL，同上控制温度。接着加入0.3mL的37℃trypsin溶液，恒温反应10min，期间不断摇晃，使溶液得以充分反应。记时结束后，迅速加入33%醋酸溶液0.3mL停止反应，最后快速使用1cm吸收皿，在410nm处测定空白组吸光值A2。依据下式计算各物质相应浓度下的的抑制效果：抑制率(%)=[(A1-A2)/A1]×100%式中：A1为不同浓度下所测的吸光值；A2为空白组的吸光值[17-18]。将各抑制剂的浓度设定为横轴，纵轴为各抑制剂相应浓度下的抑制率，绘制出关系线，并得到抑制剂摩尔浓度（x）和抑制率（y）之间的线性方程，由此可得出3种姜酚及3种姜稀酚对胰蛋白酶活性的半抑制率，以此比较6种溶液抑制效果的强弱。3.结果与分析3.16-姜酚的抑制效果的分析图1表示的是不同摩尔浓度的6-姜酚溶液的抑制作用的测定结果图。UV-1100型紫外可见分光光度计上海美谱达仪器有限公司LSY电热恒温水浴锅北京医疗设备厂3由图1可知，6-姜酚溶液的摩尔浓度对于胰蛋白酶溶液活性的抑制率具有较强的正比例关系，在0.1—0.5mol/L的摩尔浓度范围内，伴随着溶液浓度的升高，6-姜酚对胰蛋白酶活性的抑制率逐渐增大，它的抑制效果就越好，根据图1中的线性方程y=64.4x+3.7，计算出该物质的半抑制率是0.208mol/L，即IC50值是208mol/L[19-20]。3.28-姜酚的抑制效果的分析图2表示的是不同摩尔浓度的8-姜酚溶液的抑制作用的测定结果图。由图2可知，8-姜酚溶液的摩尔浓度对胰蛋白酶活性的抑制率具有较强的正比例关系，在0.1至0.5mol/L的摩浓度量范围内，伴随着溶液浓度的升高，8-姜酚对胰蛋白酶活性的抑制率增大，它的抑制效果就越好，根据图1中的线性方程y=28.3x+2.5，计算出该物质的半抑制率是0.872mol/L，即IC50值是0.872mol/L。3.310-姜酚的抑制效果的分析图3表示的是不同摩尔浓度的10-姜酚的抑制作用的测定结果图。图1不同浓度6-姜酚对胰蛋白酶活性的抑制效果图Fig.1Theinhibitoryeffectontheactivityoftrypsinbydiffidentconcentrationof6-gingerol图2不同浓度8-姜酚对胰蛋白酶活性的抑制效果图Fig.2Theinhibitoryeffectontheactivityoftrypsinbydiffidentconcentrationof8-gingeroly=64.4x+3.7R2=0.98784046525864700.10.20.30.40.56-姜酚溶液浓度(mol/L)抑制率(%)y=28.3x+2.5R2=0.97252528313437400.10.20.30.40.58-姜酚溶液浓度(mol/L)抑制率(%)4由图3可知，10-姜酚溶液的摩尔浓度对胰蛋白酶活性的抑制率具有较强的正比例关系，在0.1至0.5mol/L的摩尔浓度范围内，伴随着溶液浓度的升高，10-姜酚对胰蛋白酶活性的抑制率增大，它的抑制效果就越好，但抑制效果较弱，根据图3