医疗器械无菌检验作业指导书

无菌检验作业指导书1目的通过无菌检验，确保灭菌后产品能够达到无菌的要求。2适用范围适用于灭菌后医疗器械产品电凝镊的无菌检验。3检验依据3.1、产品注册标准3.2、《中国药典》（2010年版）3.3、GB14233.2-2005医用输液、输血、注射器具检验方法第二部分：生物试验方法3.4、GB15980-1995一次性使用医疗用品卫生标准4仪器、设备百级层流超净工作台、电热干燥箱、电热恒温培养箱、霉菌培养箱、压力蒸汽灭菌器、电子天平、PH计、冰箱、酒精灯、三角烧瓶，接种环、无菌棉签、镊子，试管架，大试管若干等。5无菌检验室的环境要求5.1无菌检验应在环境洁净度10000级下的局部百级的单向流空气区域内进行。5.2缓冲区与外界环境、无菌检验室与缓冲区之间空气应保持正压，阳性对照室与缓冲区之间空气应保持负压。无菌检验室与室外大气之间静压差应大于10Pa。无菌检验室的室温应保持18～26℃，相对湿度：45～65%。5.3无菌检验室的单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的监测。每年至少检测一次。5.4无菌检验过程中应同时检查超净工作台单向流空气中的菌落数：每次操作时在层流空气所及台面的左中右置3个营养琼脂平板，暴露30min，于30～35℃培养48小时，菌落数平均应不超过1cfu/平板。6无菌检验前的准备6.1器具灭菌、消毒6.1.1灭菌：试验过程中与供试品接触的所有器具必须采用可靠方法灭菌。可经电热干燥箱160℃以上干烤2小时，或置压力蒸汽灭菌器内121℃蒸汽灭菌30分钟后使用（根据灭菌效果验证决定灭菌参数）。所有的灭菌物品不应超过2周即用毕，否则应重新灭菌。6.1.2消毒：凡检验中使用的器材无法灭菌处理的，使用前必须经消毒处理。如无菌检验室的试管架、电子天平、工作台面、工作人员的手、橡胶吸头等。可采用消毒剂浸泡或擦拭。消毒剂应每月更换，以防止产生耐药菌株。6.1.3标识：器具的灭菌、消毒后必须做好标识，标明灭菌、消毒时间和使用有效期。6.2人员、物料进入无菌检验室6.2.1开启紫外线灯或臭氧发生器进行空间灭菌处理，消毒时间不得少于30min。6.2.2物料进入无菌检验室流程6.2.2.1脱包：进入无菌检验室的物品若有双重包装的，需将外包装在传递窗/缓冲间拆除后，传入试验室。6.2.2.2消毒：进入无菌操作室的所有培养基、供试品等的外表都应采用适用的方法进行消毒处理，以避免将外包装污染的微生物带入无菌检验室。6.2.2.3传递：查看所有进入无菌检验室的器具上的灭菌、消毒标识，是否在有效期内。符合要求的经传递窗传入无菌检验室。6.2.3人员进入无菌检验室流程6.2.3.1更鞋脱衣：在一更区脱去一般区工作鞋，穿上无菌检验室工作鞋；脱去一般区工作服。6.2.3.2洗手：首先用肥皂或洗手液在手上揉擦出泡沫，再用流水连续冲洗20秒，洗净泡沫。6.2.3.3更衣：在二更区按照从上到下的顺序穿戴无菌工作服（包括衣、帽、口罩等），要求裤子掖在上衣里，口罩掩住口鼻，帽子包裹所有头发。6.2.3.4手消毒：用消毒液浸泡双手5秒以上或用浸过消毒液的棉球擦拭双手。消毒液可用洗必泰、新洁尔灭、碘伏、75%酒精等。6.2.3.5人员进入：经缓冲间进入无菌检验室。6.2.4人员进入无菌检验室后，进一步用消毒液擦拭工作台面，戴无菌手套。7无菌检验操作要求7.1全过程必须严格执行无菌操作，防止微生物污染。7.2使用玻璃器皿应轻取轻放，避免破损，以防培养物扩散。7.3所有操作均应在近火焰区进行，且不得有大幅度或快速动作，以免搅动空气中的尘埃微粒。7.4使用金属接种器具时，用前、用后均需灼烧灭菌。7.5在接种培养物时，动作应轻、准，防止培养物溅出，产生汽溶胶，造成污染。7.6操作过程中所有的带菌物品，用后均应作消毒、灭菌处理。可在检验过程中随用随时放入消毒液缸内浸泡或消毒桶内，或在检验完成后经传递窗传至一般区，立即用压力蒸汽灭菌锅121℃灭菌30分钟。8对照菌液制备8.1无菌检验所用的菌株传代次数不得超过5代。8.2取金黄色葡萄球的普通琼脂斜面培养物，接种一白金耳至营养肉汤或者营养琼脂培养基内，在30～35℃培养18～24h后备用，同时制备0.9%氯化钠溶液加入在6支小试管内，每支试管内加9.0ml的0.9%氯化钠溶液，在压力锅内经121℃灭菌30min备用。将已配好的金黄色葡萄球菌培养菌液取1.0ml加入第一支小试管内，稀释成浓度1:10的菌液；取第一支试管内1.0ml菌液加入第二支小试管内，稀释成浓度1:100的菌液，同法稀释成浓度1:106（每ml含菌量≤100CFU）即可。8.3采用平皿计数法测定活菌数。9无菌检验培养温度硫乙醇酸盐流体培养基，置30～35℃培养。改良马丁培养基，置23～28℃培养。10无菌检验10.1抽样根据各自的产品注册标准和相应产品出厂检验规程的规定，对成品库内的产品进行抽样。一般同一个灭菌批产品检验3个单位供试品。10.2供试液准备优先采用将供试品或其有代表性的各部分直接投放入培养基内培养的方法，如供试品不适宜直接投放，可按下列方法制备供试液，应使浸提介质充分洗提供试品的浸提表面，供试液制备应按无菌操作法进行，在制备后2小时内使用。根据供试品具体特性选择下列方法：a)管类器具：按管内表面积每10cm2流过管内腔1ml浸提介质，流量约为10ml/min，收集到无菌的容器内。b)容器类器具：按容器内表面积每10cm2加入浸提介质1ml的比例，振摇数次。c)实体类器具：实体类器具按表面及每10cm2加入浸提介质1ml，振摇数次。收集上述冲洗液或浸提介质于无菌容器中。10.3接种薄膜过滤法：优先采用封闭式薄膜过滤器（集菌器），也可使用开放式薄膜过滤器。滤膜孔经不大于0.45µｍ。滤器和滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌，或直接采用无菌集菌器。a、如采用封闭式薄膜过滤器，取一副三联式集菌器，将供试液通过集菌仪过滤，使通过每只培养管的量基本均匀。然后通过集菌仪一只加120ml改良马丁培养基，另两只分别加入120ml硫乙醇酸盐培养基（其中一只做阳性对照，内加金黄色葡萄球菌液1ml）。另取一副二联集菌器，用同批的冲洗液或浸提介质120ml通过集菌仪过滤（每只约50ml），同法一只加硫乙醇酸盐培养基120ml，另一只加改良马丁培养基120ml分别作阴性对照。b、如用一般薄膜过滤器，将供试液过滤后取出滤膜，将其剪成3等份，分别置于含50ml硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基的容器中，其中两份作检验，一份作阳性对照。10.4培养、观察上述含培养基的容器分别置规定温度的恒温培养箱中，除阳性对照管培养48～72小时外，其余管培养14天。培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。如在加入供试品后、或在培养过程中，培养基出现浑浊，培养14天后，不能从外观上判断有无微生物生产，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中或划线接种于斜面培养基上，细菌培养2天，真菌培养3天，观察是否再出现浑浊或斜面有无菌生长；或取培养液涂片，染色，镜检判断是否有菌。10.5结果判断培养结束后，阳性对照管应有菌生长，阴性对管应澄清。否则，就判结果无效。所有供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定。若供试品管中任何1管显浑浊并确证有菌生长判供试品不符合规定。以一次检出为准，不得复试。当符合下列至少一个条件时，可判试验结果无效；1）无菌检验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检验法的要求；2）回顾无菌实验过程，发现有可能引起微生物污染的因素；3）阴性对照管有菌生长；4）供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌检验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的；11相关表单无菌检验原始记录菌种外购、转种记录培养基制备记录实验中废弃的带菌物品灭菌处理记录实验用稀释液、冲洗液、缓冲液制备记录浓菌液制备使用记录无菌检查原始记录产品名称检验日期生产批号规格完成日期灭菌批号效期检验者生产单位或产地检品数量校对者检验依据检验结果培养天数菌别1234567891011121314需气菌厌气菌30～35℃薄膜法样品阳性直接法1236阳性阴性真菌23～28℃薄膜法直接法789阴性培养基：硫乙醇酸盐流体培养基配制批号：改良马丁培养基配制批号：稀释液、冲洗液：□0.1%蛋白胨水溶液□PH7.0氯化钠－蛋白胨缓冲液□0.9％无菌氯化钠溶液配制批号：对照菌：对照菌菌液：取上述对照菌新鲜培养物1ml，用9ml0.9％无菌氯化钠溶液10倍系列稀释，取稀释液1ml作为对照用菌液。第代培养物，稀释级别计数结果CFU/ml设备编号：隔水式恒温培养箱：霉菌培养箱：集菌仪：无菌室菌落培养（30~35℃）时间碟号123（应≤1CFU/平板）24小时菌落数结果□符合□不符合48小时菌落数平均菌落数无菌检查结果判断：□符合规定□不符合规定菌种外购、转种记录菌种名称；金黄色葡萄球菌菌种编号：来源：购进数量（支）：1支购进时间：验收人员签名：复苏日期转种日期菌种代数培养基培养温度及时间转种数量管号操作人签名营养琼脂培养基营养琼脂培养基营养琼脂培养基营养琼脂培养基营养琼脂培养基营养琼脂培养基营养琼脂培养基营养琼脂培养基营养琼脂培养基培养基制备记录培养基名称：使用期限：日期配制方法灭菌条件℃/min配制批号制备者校对者无菌性检查备注：脱水培养基生产厂家：批号：成分：实验中废弃的带菌物品灭菌处理记录日期灭菌处理内容灭菌方法操作人备注浓菌液制备使用记录菌种名称：菌种编号：来源：培养基：制备日期菌种代数制备数量（支）培养条件（℃/h）使用日期稀释倍数稀释菌液浓度（个/ml）制备者用途使用者