坐骨神经-腓肠肌标本制备

坐骨神经-腓肠肌标本制备一、实验目的要求1、学习蛙类动物单毁髓与双毁髓的方法。2、学习并掌握坐骨神经-腓肠肌标本及腓肠肌标本的制备方法。3、了解电刺激的极性法则。二、实验原理1、蛙或蟾蜍等两栖类动物的一些基本生命活动和生理功能与温血动物相似，而其离体组织生活条件易于掌握，在任氏液的浸润下，神经肌肉标本可较长时间保持生理活性。因此，在生理学实验中常用蛙或蟾蜍坐骨神经腓肠肌离体标本来观察神经肌肉的兴奋性、兴奋过程以及骨骼肌收缩特点等。2、细胞的静息膜电位为外正内负，电刺激可改变可兴奋细胞的膜电位差。膜电位减小时，细胞去极化，细胞兴奋；膜电位增大时，细胞超极化，细胞兴奋性被抑制。蘸有任氏液的锌铜弓接触活组织时，可产生沿锌片—活组织—铜片流向的电流对细胞产生刺激效应。三、实验材料和仪器1、实验材料：牛蛙2、实验器材：手术剪、手术镊、手术刀、眼科剪、眼科镊、毁髓针、蛙板、固定针、滴管、培养皿、玻璃分针锌铜弓、污物缸、粗棉线、任氏液四、实验步骤1、洗净实验动物→毁髓→剥制后肢→分离坐骨神经→游离腓肠肌→游离股骨头→标本检验→电刺激极性法则的验证2、双毁髓一只手握住牛蛙，使其背部向上。用拇指压住牛蛙背部，食指按压其头部前端，另一只手持毁髓针，由两眼之间沿中线向下触划，触及凹陷处即为枕骨大孔。将毁髓针垂直刺入枕骨大孔。将针尖向前刺入颅腔内搅动，此时为单毁髓；将毁髓针退回枕骨大孔，针尖转向后方，与脊椎平行刺入椎管内捣毁脊髓，完成双毁髓。3、坐骨神经-腓肠肌标本制备（1）剥制后肢标本:轻提双毁髓蛙，自背面耻骨联合上方约1公分处横向剪断脊柱。轻轻托起后肢，看清坐骨神经位置，沿脊柱两侧横向切口剪断体壁，去除断口以上肢体和内脏放入污物缸。剥去后肢皮肤后放入任氏液中备用。（2）分离两后肢：用粗剪刀纵向剪开脊柱，并剪断两后肢相连的肌肉，一只用于剥制标本，一只放入任氏液中保存。（3）分离坐骨神经：将后肢标本脊柱端腹面向上，趾端向外侧用蛙钉将标本固定在蛙板上。先在腹腔面用玻璃分针沿脊柱游离坐骨神经,然后在标本的背侧于股二头肌与半膜肌的肌肉缝内将坐骨神经与周边的结缔组织分离直到腘窝，但不要伤及神经，其分支待以后用手术剪剪断肌肉。（4）游离腓肠肌：同样用玻璃分针将腓肠肌与其下的结缔组织分离并在其跟腱处穿线、结扎；（5）分离股骨头：捏住股骨，剪去并刮净周围肌肉，保留股骨的后2/3，剪断股骨;（6）检验标本：用手术镊轻提标本的脊椎片，再用经任氏液蘸湿的锌铜弓接触坐骨神经，如腓肠肌发生收缩，则表示标本机能正常。轻提腓肠肌上的结扎线，将标本放入任氏液中保存15-20分钟后进行实验。（7）电刺激的极性法则验证：用棉线在神经干中间部位进行结扎，以阻断神经传导兴奋的能力。用锌铜弓跨越结扎线刺激坐骨神经干。使锌极在腓肠肌一端刺激，观察腓肠肌收缩发生在通电（接触神经干）时还是断电（离开神经干）时；调转锌铜弓的极性，使铜极在腓肠肌一端刺激，观察腓肠肌收缩实在通电时还是断电时。比较不同极性电极刺激时腓肠肌的收缩强度是否一样，那个收缩强度比较大？五、注意事项1、避免血液污染标本，压挤、损伤和用力牵拉标本，不可用金属器械触碰神经干。2、在操作过程中，应给神经和肌肉滴加任氏液，防止表面干燥，以免影响标本的兴奋性。3、标本制成后须放在任氏液中浸泡数分钟,使标本兴奋性稳定,再开始实验效果会较好。六、实验结果通过任氏液浸泡，刺激后，看到肌肉有收缩的反应，调换电极进行刺激后也同样有收缩反应。通过铜—锌与锌—铜的两种刺激比较后，铜—锌更强。七、总结通过本次试验更加深刻的认识了肌细胞收缩的机制，熟悉了单毁髓与双毁髓的方法和操作，掌握l坐骨神经-腓肠肌标本及腓肠肌标本的制备方法的基本操作。由于实验过程中提取腓肠肌时候，肌肉过度兴奋，进行电极刺激时现象不是非常明显。综上所述实验时需小心操作，尽量避免肌肉失活。八、思考题1、剥去皮肤的后肢，能用自来水冲洗吗？为什么？答：不能。因为自来水中还有例如氯离子、钙离子等许多离子，它们会影响细胞膜的点位分布，最终就会影响到刺激反应现象的观察；另外自来水里有许多微生物如果它们附着与誓言材料上，也会影响实验效果的。2、金属器械碰压、触及或损伤神经及腓肠肌，可能引起哪些不良后果？答：金属器械碰压、触及或损伤神经及腓肠肌会损伤腓肠肌细胞膜，使肌肉中的神经收到过度刺激，而过度兴奋最终失活，刺激时候就没有现象。3、如何保持标本的机能正常？答：首先在制备腓肠肌的过程时，金属器械不要碰及、损伤神经或腓肠肌，以及实验者不要触碰到肌肉；其次，过程中要保持腓肠肌的湿润，常加任氏液，最好先泡一会；另外，在第一次电刺激后，需要让肌肉休息一段时间，在进行下一次刺激。实验一蟾蜍坐骨神经腓肠肌标本制备一、实验目的掌握制备具有正常兴奋收缩功能的蛙类坐骨神经腓肠肌标本基本操作技术，掌握蛙类手术器械的使用方法。二、材料和方法1、材料蟾蜍；任氏液；探针、剪刀、培养皿、瓷盆、玻璃分针、蛙板、玻璃板、大头针、镊子、线、锌铜弓。2、实验方法2.1毁脑脊髓取蟾蜍一只，用左手握住，以食指压其头部前端使其尽量前俯，右手持探针自枕骨大孔处垂直刺入，到达椎管，即将探针改变方向刺入颅腔，向各侧不断搅动，彻底捣毁脑组织；再将探针原路退出，刺向尾侧，捻动探针使逐渐刺入整个椎管内，捣毁脊髓。此时蟾蜍下颌呼吸运动应消失，四肢松软，即成为一毁脑脊髓的蟾蜍。否则须按上法再行捣毁。2.2剪除躯干上部及内脏用粗剪刀在颅骨后方剪断脊柱。左手握住蟾蜍脊柱，右手将粗剪刀沿两侧（避开坐骨神经）剪开腹壁。此时躯干上部及内脏即全部下垂。剪除全部躯干上部及内脏组织，弃于瓷盆内。2.3剥皮避开神经，用右手拇指和食指夹住脊柱，左手捏住皮肤边缘，逐步向下牵拉剥离皮肤。拉至大腿时，如阻力较大，可先剥下一侧，再剥另一侧。将全部皮肤剥除后，将标本置于盛有任氏液的培养皿中。2.4洗净双手和用过的全部手术器械，再进行下列步骤。2.5分离双腿避开坐骨神经，用粗剪刀从背侧剪去骶骨，然后沿中线将脊柱剪成左右两半，再从耻骨联合中央剪开（为保证两侧坐骨神经完整，应避免剪时偏向一侧）。将已分离的标本浸入盛有任氏液的培养皿中。2.6游离坐骨神经取腿一条，先用剥离分针沿脊柱侧游离坐骨神经腹腔部，然后用大头针将标本背位固定于干净蛙板上。用玻璃分针循股二头肌和半膜肌之间的坐骨神经沟，纵向分离暴露坐骨神经之大腿部分，直至分离至腘窝颈神经分叉处。然后剪断股二头肌腱、半膜肌和半膜肌肌腱，并绕至前方剪断股四头肌腱。自上向下剪断所以坐骨神经分支。将连着3-4节椎骨的坐骨神经分离出来。2.7完成坐骨神经小腿标本将已游离的坐骨神经搭在腓肠肌上。用粗剪刀自膝关节周围向上剪除并刮净所以大腿肌肉，在距膝关节约1cm处剪断股骨。弃去上段股骨，保留部分即为坐骨神经小腿标本。2.8完成坐骨神经腓肠肌标本用尖子镊子在上述坐骨神经腓肠肌标本的跟腱下方穿孔，穿线结扎之。提起结扎线，在结扎线下方剪断跟腱，并逐步游离腓肠肌至膝关节处，左手握住标本的股骨部分，使已游离的坐骨神经和腓肠肌下垂，右手持粗剪刀水平方向伸进腓肠肌与小腿之间，在膝关节处剪断，与小腿其余部分分离。左手保留部分即为附着于股骨之上的、具有坐骨神经支配的腓肠肌标本。将标本浸入盛有新鲜任氏液的培养皿中待用。2.9实验观察2.9.1蟾蜍毁脑脊髓前后四肢肌张力的变化。2.9.2用锌铜弓分别刺激坐骨神经和腓肠肌，观察肌肉的反应。三、实验结果用锌铜弓刺激坐骨神经时腓肠肌发生收缩。四、分析锌铜弓用金属锌和铜铆接而成，锌铜弓在极性溶液中形成回路时，锌与铜两极产生约0.5-0.7V的直流电压，电流的刺激作用于神经肌肉标本，由于产生生物电流，因而引起肌肉的收缩。制备标本的过程中，要不断滴加任氏液，以防标本干燥，丧失正常生理活性；操作过程中应避免强力牵拉和手捏神经或夹伤神经肌肉；毁脑脊髓时防止蟾蜍皮肤分泌的蟾蜍毒液射入操作者眼内或污染实验标本。五、结论蛙类的某些基本生命活动和生理功能与哺乳类动物有相似之处，而且其离体组织的生活条件比较简单，易于控制和掌握，来源也较丰富，由此在生理学实验，尤其是细胞生理学的某些实验中，常用蛙或蟾蜍的坐骨神经腓肠肌标本来观察神经肌肉的兴奋性、刺激与反应的规律及肌肉收缩的特点等。制备具有正常兴奋收缩功能的蛙类坐骨神经腓肠肌标本是生理学实验的基本操作技术之一。