实验16酶的特异性和影响酶反应速度的因素

实验16酶的特异性和影响酶反应速度的因素一、目的1、了解酶的特异性。2、了解温度、pH值、激活剂和抑制剂等因素对酶反应速度的影响。3、掌握检查酶的特异性，酶的激活剂和抑制剂影响酶反应速度的方法及原理。4、学习测定酶最适pH值的方法。二、原理酶是生物体中具有催化功能的蛋白质，因此也叫生物催生剂。生物体内存在多种多样的酶，从而使生物体在温和的条件下能迅速完成复杂的生物化学反应。酶具高度的特异性。所谓特异性是指一种酶能对一种化合物或一类化合物起催化作用，而不能对别的物质发生催化反应。淀粉和蔗糖无还原性。唾液淀粉酶水解溶粉生成有还原性的麦芽糖，但不能催化蔗糖水解。蔗糖酶能催化蔗糖水解产生还原性的葡萄糖和果糖，但不能催化淀粉水解，用Benedict试剂检查糖的还原性。温度和pH对酶的活性有显著的影响，使反应速度达最大反应值时的温度称为某种酶作用的最适温度。大多数动物酶的最适温度为37℃~40℃，植物酶的最适温度为50℃~60℃，能使酶表现其活性最高时的pH值称为该酶的最适pH值，不同酶的最适pH值不同。酶的活性常受某些物质的影响，能使酶活性增加的物质称为酶的激活剂，能使酶的活性降低的物质称为酶的抑制剂。氯离子为唾液淀粉酶的激活剂，铜离子为其抑制剂。三、材料、试剂与器具（一）材料1、干酵母2、黄豆粉（二）试剂1、2%蔗糖溶液：蔗糖是典型的非还原糖，若商品蔗糖中还原糖含量超过一定标准，则呈现还原性，这种蔗糖不能使用，所以实验必须进行检查，本实验用的蔗糖至少应是分析纯的试剂。2、0.3%氯化钠的1%淀粉溶液（新配制）。3、释释200倍的新鲜唾液（5滴唾液，加蒸馏水稀释至50毫升）。4、蔗糖酶溶液：取干酵母100克，置于乳钵内，加适量的蒸馏水和少量石英砂，用力研磨提取1小时，再加蒸馏水使总体积约500毫升，过滤，将滤液保存于冰箱备用。5、本尼迪克特试剂（Benedict）：将硫酸铜17.3克溶于100毫升热蒸馏水中，冷却，稀释至150毫升，取柠檬酸钠173克及无水碳酸钠（Na2CO3）100克，加水600毫升，加热使之溶解，冷后后稀释至850毫升。最后把硫酸铜溶液缓缓倒入柠檬酸钠一碳酸钠溶液中，摇匀，用细口瓶贮存，此试剂可以保存很久。6、0.1%淀粉溶液。7、1%氯化钠溶液。8、1%硫酸铜溶液9、1%的硫酸钠溶液10、碘化钾—碘溶液（稀）。11、0.3%氯化钠0.2%淀粉溶液。12、1%尿素溶液13、脲酶提取液：取黄豆粉6克，加30%乙醇250毫升，振荡10分钟，过滤，可保存1~2星期。14、奈斯勒试剂：称取5克碘化钾，溶于5毫升蒸馏水中，加入饱和氯化汞溶液（100毫升约溶解5.7克氯化汞）并不断搅拌。直至产生的朱红沉淀不再溶解时，再加40毫升50%氢氧化钠溶液，稀释100毫升，混匀，静置过夜，倾出清液于棕色瓶中。15、0.3%氯化钠的0.5%淀粉溶液（新配制）16、0.2M磷酸氢二钠溶液17、0.1M柠檬酸溶液（三）器具1、试管及试管架2、移液管（1，2，5毫升）3、冰浴4、恒温水浴5、白瓷板6、秒表四、操作步骤（一）酶的特异性1、淀粉酶的特异性实验取试管6支，编号，按下表进行操作管号1234561%淀粉溶液（滴）4442%蔗糖溶液（滴）444稀释唾液（ml）11煮沸过的稀释唾液（ml）11蒸馏水（ml）1137℃恒温水浴15分钟Benedicty试剂（ml）222222沸水浴2~3分钟现象解释结果2、蔗糖酶的特异性实验取试管6支，编号，按下表进行操作管号1234561%淀粉溶液（滴）4442%蔗糖溶液（滴）444蔗糖酶溶液（ml）11煮沸过的蔗糖酶溶液(ml)11蒸馏水（ml）1137℃恒温水浴15分钟Benedict试剂(ml)222222沸水溶2-3分钟现象解释结果（二）酶的激活剂及抑制剂取试管4支，编号，按下表加入试剂管号12340.1%淀粉溶液（ml）3333稀释唾液(ml)11111%硫酸铜溶液(ml)11%氯化钠溶液（ml）11%硫酸钠溶液(ml)1蒸馏水(ml)137℃恒温水浴、保温10分钟碘化钾——碘溶液（滴）2~32~32~32~3现象解释结果说明本实验第3管的意义。（三）温度对酶活性的影响1、温度对唾液淀粉酶活性的影响唾液淀粉酶可将淀粉逐步水解成各种不同大小分子的糊精及麦芽糖。它们遇碘各呈不同的颜色。直链淀粉（即可溶性淀粉）遇碘呈蓝色，糊精按分子从大到小的顺序遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色和红色，最小的糊精和麦芽糖遇碘不呈颜色。由于不同温度下唾液淀粉酶的活性高低不同，则淀粉被水解的程度不同。所以，可由酶反应混合物遇碘所呈现颜色来判断。取3支试管，编号后各加0.3%氯化钠的0.2%的淀粉溶液2毫升。将第1、2号试管放入37℃恒温水浴中保温，第3号试管放入冰水中冷却，5分钟后，向第1号试管中加入煮沸5~15分钟的稀释唾液1毫升，向第2，3号试管加稀释唾液各1毫升。摇匀。20分钟后取出3支试管，各加入碘化钾—碘溶液2滴，混匀，比较各管溶液的颜色。判断淀粉被唾液酶水解的程度，并说明温度对唾液酶活性的影响。2、温度对脲酶活性的影响脲酶能催化尿素水解生成氨和二氧化碳，氨可以与奈斯勒试剂作用生成红色化合物。由颜色深浅可断定反应进行的程度。NH2NH2脲酶C=O+H2O——→2NH3+CO2NaIOHKIINHHgHgONaOHKCLHgINH3243)2(22223奈斯勒试剂碘化双贡铵（橙黄色）取4支试管，编号，向每支试管中加入脲酶提取液1毫升。将第1号试管放在冰水里冷却，第2号试管在室温上放置，第3号试管在50℃恒温水浴中保温，第4号试管在沸水中煮。5分钟后分别向4支试管中加入1%尿素溶液1毫升，混匀，10分钟后取出4支试管，将第3，4号试管用流动的自来水冷却至室温。然后向4支试管中加入奈斯勒试剂5滴，摇匀。观察比较各试管颜色深浅，并说明温度对脲酶活性的影响。（四）pH对酶活性的影响（一）取4个50毫升锥形瓶，编号。按下表中的比例，用吸量管添加0.2M磷酸氢二钠溶液0.1M柠檬酸溶液，制备pH5.0~8.0的4种缓冲液。编号0.2M磷酸氢二钠Na2HPO4(毫升)0.1M柠檬酸C6H8O7H2O(毫升)缓冲液pH15.154.855.026.053.955.837.722.286.849.270.288.0从4个锥形瓶中各取缓冲缓3毫升，分别放入4支带有号码的试管中，随后于每个试管中添加0.3%NaCl0.5%淀粉溶液2毫升和稀释200倍的唾液2毫升，向各试管中加入稀释唾液的时间间隔为1分钟。将各试管中物质混匀，并依次置于37℃恒温水浴中保温。待向第4管加入唾液2分钟后，每隔1分钟由第3管取出1滴混合液，置于白瓷板上，加1小滴碘化钾—碘溶液，检验淀粉的水解程度。待混合液变为棕黄色时，向所有试管依次添加1—2滴碘化钾—碘溶液，加碘化钾—碘溶液的时间间隔，从第1管起，亦均为1分钟。观察各试管中物质呈现的颜色，分析pH对唾液淀粉酶活性的影响。五、实验报告以表格的形式总结酶的特异性及各种因素对酶促仅应的影响，并解释结果。六、思考题1、什么是酶的特异性？本实验结果为什么能说明酶具有这种性质？2、用煮沸后的蔗糖酶水解淀粉或蔗糖会产生什么现象？这种试验与操一(一)的作法有何区别，试说明酶学实验中安排对照实验的必要性。3、激活剂与变性剂有何不同？试举例说明。4、抑制剂与变性剂有何不同？试举说明。5、为什可以用碘化钾—碘溶液作指示剂检查温度对唾液淀粉酶活性的影响？6、酶在干燥的情况下与在水溶液中，它的活性受温度的影响是否相同？这种性质对酶的保存有何意义？7、酶反应的pH是否是一个常数？它与哪些因素有关？这性质对于选择测定酶活性的条件有什么意义？8、通过几个酶实验，你对下面问题如何认识？（1）酶作为生物催化剂具有哪些特性/（2）进行酶的实验必须注意控制哪些条件？为什么？