实验3质粒的提取和鉴定090226

碱变性法小量提取质粒DNA的限制性酶切厦门大学医学院分子生物学实验教学组目的•掌握碱裂解法提取质粒DNA的方法:最常用的提取基因工程中运载基因的载体•掌握质粒酶切鉴定原理,学会根据目的基因和实验目的选择合适载体与限制性内切酶，设计构建体外重组分子•质粒(plasmid)是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的DNA分子，在基因工程中质粒常被用做基因的载体。质粒DNA的提取方法•方法：碱裂解法；煮沸裂解；羟基磷灰石柱层析法，质粒DNA释放法；酸酚法等。概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理•所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离质粒DNA(有时还要求纯化质粒DNA，根据实验所需)•选择哪一种方法主要取决于以下几个因素：质粒的大小、大肠杆菌菌株、裂解后用于纯化的技术和实验要求碱裂解法基本原理：1.当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不复性而呈絮状，离心时可沉淀下来2.在一定电场强度下，DNA分子的迁移取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型(相对分子质量不同的DNA片段泳动速度不一样)，且DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。因此，凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子：其中超螺旋结构泳动最快，其次为线性结构，最慢的可能是复制中间体（没有复制完的两个质粒连在一起），而不是开环结构（用EcoRI来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒DNA的位置与这三条带的位置不一样）3.溴化乙锭是一种荧光染料(3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐)，其分子可以嵌入到核酸的碱基对之间，在紫外线的激发下，发出橙色荧光原理示意图•限制性核酸内切酶:一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶。限制性切酶以内切的方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5’端带磷酸基团，3’端为-OH。限制性核酸内切酶分类•识别切割特性•催化条件•是否具有修饰酶活性•至2005年1月，共发现限制酶3681种–Ⅰ型59种–Ⅱ型3612种–Ⅲ型10种•商业化的限制酶有588种，在Ⅱ型限制酶中共有221种特异性。Ⅱ型限制与修饰系统•占90%以上，即通常指的DNA限制性内切酶，它们能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的DNA片段；•Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为4-6个碱基对的反转重复顺序；•Ⅱ型内切酶切割双链DNA产生3种不同的切口：5’端突出，3’端突出和平末端。酶切反应中应注意以下几个问题：1.内切酶：不应混有其他杂蛋白特别是其他内切酶或外切酶的污染；注意内切酶的识别位点和形成的粘性末端；2.内切酶的用量：根据内切酶的单位和DNA用量而定。使用中一般以1µgDNA用2-3U酶进行酶切为宜；3.内切酶体积：不能超过反应体系的10%，因内切酶中含50%甘油，体系中甘油超过5%会抑制内切酶的活力；4.操作条件：应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中对内切酶的污染。5.DNA：作为内切酶的底物，DNA应该具备一定的纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、SDS和酒精等，这些因素的存在均在不同程度影响限制性内切酶的活性。反应缓冲液：1.反应缓冲液:主要由Tris-HCl、NaCl、Mg2+组成，其中Mg2+为内切酶的辅基；A.Tris-HCl维持反应体系的PH值在7.2~7.6之间；B.NaCl浓度：低盐(10mMNaCl)中盐(50mMNaCl)高盐(100mMNaCl)2.酶解的温度：大多数限制酶的反应时间为37℃，如EcoRⅠ、HindⅢ、BamHⅠ、PstⅠ等，也有如BclⅠ需在50℃下进行反应。3.酶解反应时间：根据酶的单位与DNA用量之比来定，原则是酶/DNA＝2~3，12小时即可充分酶解。4.酶单位定义：在每种内切酶理想的反应条件下，0.05mL反应混合物中,1小时消化1μg底物DNA的酶量为1单位(1U)。三质粒提取实验材料与试剂（一）实验材料：过夜培养大肠杆菌DH-5a（二）实验试剂：LB培养基0.1MNaCL、10mMTris.CL（pH8.0）、1mMEDTA、Amp50mg/ml、酚、氯仿、Rnase、琼脂糖TE：10mMTris.CL（pH8.0），1mMEDTA溶菌酶10mg/ml（用10mMTris.CL，pH8.0，新鲜配制）•溶液Ⅰ—溶菌液：50mM葡萄糖，25mMTris.Cl（pH8.0），10mMEDTA，2mg/ml溶菌酶。•溶液Ⅱ—NaOH-SDS液：0.2NNaOH，1%SDS。•溶液Ⅲ—3mol/LNaAc（pH4.8）溶液：5MKAC10ml，冰醋酸11.5ml，水28.5ml。四步骤(一)细菌培养与质粒扩增1.挑单克隆E.coli菌株接种到4mlLB培养液中（含Amp50µg/ml），37℃225rpm振荡培养过夜。（活化菌种）2.从中取2ml种子菌液于含Amp培养基500ml中，37℃振荡培养3-4小时（OD600＝1.0）3.取4ml培养液至Eppendorf管中，12000rpm，4℃离心30秒，弃上清，用1mlSTE悬浮菌体，再离心回收菌体，并重复一次，弃上清，取沉淀。步骤二质粒提取1.取4ml培养物至Eppendorf管中，12000rpm，4℃，离心30sec，弃上清。2.用1mlSTE悬浮菌体，再离心回收菌体，并重复一次，弃上清取沉淀，使细胞沉淀尽可能干燥。3.将细菌沉淀悬浮于100μl预冷的溶液I中，加入10µl溶菌酶（10mg/ml），剧烈振荡均匀，冰上放置1分钟。4.加200μL溶液II（新鲜配制），盖紧Eppendorf管，快速轻柔颠倒5次，混匀内容物，将Eppendorf管放在冰上3分钟。5.加入150μL溶液III（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀，冰上放置5min。6.12000r/min，4℃离心5min，将上清夜转至另一1.5mlEppendorf管中。7.加入等体积酚/氯仿（1：1），振荡混匀，室温放置5-10min，12000rpm，4℃下离心2分钟，倒去上清，把Eppendorf管倒扣在吸水纸上，吸干液体。8.加入2倍体积冰预冷无水乙醇，振荡混匀，12000rpm4℃离心5分钟。•9.倒去上清，加入1ml冰预冷70%乙醇振荡漂洗DNA沉淀。12000rpm，4℃离心2分钟。•10．弃上清并尽量吸除液体，打开管盖，室温放置5min。室温放置15min干燥。•11．50μLTE缓冲液（含无DNase的RNase20µg/ml），使DNA完全溶解（-20℃保存）•12．取样品10µl加2ul6×Loadingbuffer于1%琼脂糖电泳，电泳凝胶在凝胶成像系统上成像。双酶切实验材料•限制性内切酶：EcoRⅠ、XbaⅠ和HindⅢ•DNA：λDNA和质粒pCDNA-p38•10×bufferH（37℃,PH7.5）90mMTris•Cl50mMNaCl10MMgCl2•10×bufferM（37℃,PH7.5）6mMTris•Cl100mMNaCl6MMgCl2•1mMDTT•10×BSA：1mg/ml•无菌水方法和步骤1.反应体系配制：质粒pCDNA3－p3810µl（1µg）10×bufferM2µl10×BSA2µlEcoRⅠ1µlXbaⅠ1µlH2O4µl—————————————————总体积20µl2.将反应体系充分混匀，并于台式离心机上短暂离心收集液体。3.Eppendorf管于37℃水浴中反应2~3小时。4.反应结束后70℃灭活15min或者加入EDTA至终浓度10mM终止反应。5.取20µl反应液加入6×loadingbuffer混匀于1.2％琼脂糖凝胶胶上150伏电泳，约30min加入5µl未酶切对照。6.凝胶成像体系观察记录结果。7.当DNA条带充分分开后，在紫外灯下细心切取所要的DNA条带。尽量去除多余的凝胶。紫外灯照射DNA片段不要超过30秒。注意保护眼睛免受紫外线伤害。五实验结果•双链DNA样品浓度(μg/μl)=OD260×核酸稀释倍数×50/1000。•RNA样品浓度(μg/μl)=OD260×核酸稀释倍数×40/1000。（在波长260nm紫外光下，1OD值的吸光度相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA为37μg/ml；RNA为40μg/ml。）凝胶成像结果1.2%AgaroseGel12341.1000bpDNAladder2.CDNA3-p38/EcoRI+XbaI3.ppCDNA3-p384.100bpDNAladder六．注意事项为提高质粒产量，要注意下面步骤：•加入溶液I后，涡旋振荡应充分打散菌体使之均匀悬浮；•加溶液II裂解要完全(快速轻柔颠倒5-10次)，使蛋白质和核酸变性；•加溶液III后PH要达到中性(轻柔振荡5-10次)，使质粒DNA复性，这样才能使质粒DNA与染色体DNA完全分开，否则，难分开，所以裂解和复性这两步要从严掌握。•加入乙醇沉淀DNA时，要把离心管盖上盖子倒翻摇动几次，注意观察水相和乙醇之间没有分层现象之后，才可以放到冰箱中去沉淀DNA。七．思考题1.要得到高质量质粒样品，用碱变性法小量提取质粒时要注意什么事项？2.溶液I、溶液II和溶液III的作用是什么？在实验中分别加入上述溶液后反应体系出现的现象及其成因是什么？3.酚氯仿抽提时DNA溶液体系出现什么现象？为什么？4.沉淀DNA时为什么要用无水乙醇及在高盐、低温条件下进行？5.在整个酶切反应过程中应注意哪些问题？6.如何选择DNA和限制性内切酶的用量？7.反应体系中为何内切酶用量不能超过整个反应体系的10%？注意•EB是诱变剂，配制和使用EB染色液时，应带乳胶手套或一次性手套，并且不要将该染色液洒在桌面或地面上，凡是沾污EB的器皿或物品，必须进行清洗或弃去