实验二植物基因组DNA的提取笔记

实验二植物基因组DNA的提取Tris读音“吹斯”脱氧核糖核酸酶DNase是一种可以消化单链或双链DNA产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶DNaseI活性依赖于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。镁离子存在条件下，DNaseI可随机剪切双链DNA的任意位点；二价锰离子存在条件下，DNaseI可在同一位点剪切DNA双链，形成平末端，或1-2个核苷酸突出的粘末端。苯酚在空气中经常被氧化生成醌，它能够产生自由基，直接用于DNA分离，会使磷酸二酯键断裂，造成DNA降解。苯酚使蛋白变性，离心时沉淀下来，而DNA溶解在溶液中。在提取DNA时用的原料成分的关系,很多植物源提取材料里面含有酚类物质,酚类物质是芳族环上的氢原子被羟基或功能衍生物取代后生成的化合物.酚类物质如果经氧化后就会很容易于DNA共价结合引起褐变.这就是褐变现象,为有效除去酚类物质，需要在研磨时加入抗氧化的PVP，用PVP是利用它的“CO-N=”基有很强的结合多酚化合物的能力，其结合能力随多酚化合物中芳环羟基数量的增加而加强，结合成复合物后,通过离心除去。另外，在加入提取液时，加入B-巯基乙醇可使多酚氧化酶失活，防止酚类物质被氧化，主要是“-SH基”可以打断多酚氧化物酶的二硫键而使之失活，防止酚类化合物被氧化。巯基乙醇加入的目的是提供一种还原剂，这样酚类物质就不能被氧化成醌，从而影响你提DNA的实验。巯基乙醇兼有这两方面功能，消泡和保护DNA。特别是样品中酚类物质较多的时候，可以适当增加巯基乙醇的量，DNA提取的成功率更高。巯基乙醇有消泡的作用。不然你加了CTAB在震荡过程中会出现大量气泡，影响后续操作。不是用来防止DNA氧化的。PVP粉才是用来防止氧化的。还原剂，防止酚的氧化。很重要。如果不加提出的核酸会呈现灰黑色。异戊醇的作用是消除抽提过程中出现的泡沫。我们实验室是灭菌后加PVP和巯基乙醇,每次用前65度水浴。加CTAB时应在通风橱中进行。RNase是一种核糖核酸内切酶，即RNA（水解酶）它能够特异性地水解杂交到DNA链上的RNA磷酸二酯键，故能分解RNA/DNA杂交体系中的RNA链。该酶不能消化单链或双链DNA。RNaseA对RNA有水解作用，但对DNA则不起作用。可以用来去除DNA制品中的污染RNA。λDNA/HindⅢMarker是由λDNA经HindⅢ完全酶切并经灭活处理而成，共有8条DNA片段，已加入上样缓冲液，可直接电泳，每次上样5μl，浓度为0.1μg/μl。bp)：125、564、2027、2322、4361、6557、9416、23130储存：-20℃可保存一年以上，4℃可保存2-3个月。目录号包装价格MD202-5050T90.00MD202-100100T150.00Tris饱和酚瓶/250mlPVP(聚乙烯吡咯烷酮)：加入PVP的目的是使PVP吸附酚类物质，这样就可减轻酚类物质对你所提DNA的影响。PVP是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。PVP为一种水溶性高分子聚合物,化学名称为聚乙烯吡咯烷酮，是一种有机物。个人认为不适合提前加入和CTAB提取液一起高压灭菌。我们实验室是灭菌后加PVP和巯基乙醇,每次用前65度水浴。加CTAB时应在通风橱中进行。聚乙烯吡咯烷酮PVP-40Sigma-Vetec原装V900008-100g。“植物材料中,特别是老的或是经逆境处理的材料,含有大量的酚类化合物,这些酚类化合物氧化后易与DNA共价结合,使DNA带棕色或褐色,并能抑制DNA的酶解反应.为防止这类情况出现,可以向提取缓冲液中加入2%(W/V)的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或增加抽提缓冲液中的巯基乙醇的浓度”，“在植物总DNA提取过程中加入PVP，可以防止植物细胞中的多酚类物质氧化”DNA的存在形式分两个方面：如果在体外（如提取出来的），存在状态多样，可以是链状（动植物基因组DNA），可以是环状（质粒DNA），可以是单独存在也可以结合其他物质存在，可以单链存在也可以双链存在，可以有序存在也可以杂乱存在，等等啦。如果是在体内，真核生物。原核生物还有病毒又不一样，真核生物基因组DNA是经过四级包装形成了染色体，先是DNA形成双螺旋结构，再与组蛋白形成核小体（一级结构），压缩7倍，再形成螺旋管（二级结构），压缩6倍，之后再形成超螺旋管（三级结构），压缩40倍，最后超螺旋管压缩形成染色体（四级结构），再压缩5倍，正常细胞中基因组DNA是以染色质（相当于一级结构）形式存在，在细胞分裂的中期以染色体形式存在，真核生物细胞质DNA主要是以裸露的环状DNA形式存在，没有核小体结构。原核生物拟核区基因组DNA大多是环状裸露DNA，呈弥散状分布，而细胞质中的质粒DNA也是环状，裸露，多呈超螺旋。病毒基因组比较多样化，可以是DNA，也可以是RNA，可以是环状，也可以是链状，可以是一条，也可以是多条，但都是裸露的，没有类似于核小体的结构。CTAB法提取DNA的原理及步骤：冷冻的植物组织，在低温干燥状态下机械磨碎。通常精提DNA，都要加液氮使材料变脆，易于研磨。低温降低了DNase的活性，利用CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）去污剂溶解细胞膜，使核蛋白等解聚，使DNA游离出来。CTAB作为一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，与核酸形成复合物，可使核酸沉淀出来。通过离心将CTAB-核酸复合物语糖类、蛋白质等分离开来。随后将复合物溶于高盐溶液中，再加乙醇使核酸沉淀，而CTAB溶于乙醇，从而去除CTAB。=======================1.异丙醇和乙醇沉淀质粒的区别：异丙醇和酒精都是有机溶剂，一般来讲，提取质粒的时候一开始都要用异丙醇沉淀，因为异丙醇沉淀的效果要好一些，但最后大多用酒精沉淀，因为酒精容易挥发，对下游的实验影响小。异丙醇比较疏水，能很更好地沉淀核酸，用乙醇的目的是去盐，它比异丙醇更亲水，所以能去掉一些盐离子。有时还用70%的乙醇洗样品也是为了增加盐的溶解度。在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇，乙醇的极性要强于异丙醇，所以一般用2倍体积乙醇沉淀，但在多糖、蛋白含量高时，用异丙醇沉淀可部分克服这种污染，尤其用异丙醇在室温下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白污染更为有效。异丙醇沉淀核酸时，高浓度盐存在将使大量多糖存在在溶液中，从而可达到去多糖的作用。但高浓度的盐存在会影响核酸的进一步操作，因此必须用乙醇多次洗涤脱盐。异丙醇：优点为所需容积小且速度快，适用于浓度低，而体积大DNA样品的沉淀。0.54~1.0倍体积的异丙醇可选择性沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA；但对5sRNA、tRNA和多糖产物不产生沉淀，一般不需要在低温条件下长时间放置。缺点：易使盐类（如NaCl、蔗糖）与DNA共沉淀；在DNA沉淀中异丙醇难以挥发除去，所以常规需要用70％的乙醇漂洗DNA沉淀数次。乙醇：沉淀DNA乙醇是首选的有机溶剂，对盐类沉淀少，DNA沉淀中所含的衡量乙醇易蒸发去处，不影响以后的实验。在适当的盐浓度下，2倍样品容积的95％乙醇可有效沉淀DNA，对于RNA则需要将乙醇量增加至2.5倍。缺点是总体积较大。需在-20放置很长时间，30分钟-1小时。同样需要70%乙醇洗涤。2.一般用的是酚：氯仿：异丙醇为25：24：1（v/v）其中酚是强烈的蛋白质变性剂，能有效使蛋白质变性而除去，氯仿有强烈的脂溶性，去除脂类杂质，本身酚：氯仿：异戊醇=25：24：1的主要作用是抽提蛋白质。步骤：质粒用等体积的酚/氯仿/异丙醇抽提一次，重复此步骤，加入两倍体积的无水乙醇和1/10体积的3mol/L乙酸钠溶液后混匀，零下20摄氏度沉淀30min后12000r/min离心10min，沉淀用75%乙醇洗涤一次，12000r/min离心5min，弃上清，沉淀自然干燥后溶于20～40微升去离子水中或者0.5mol/LpH8.0的TE中。3.用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。使用酚的优点：1.有效变性蛋白质；2.抑制了DNase的降解作用。缺点：1.能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly（A）RNA。2.不能完全抑制RNase的活性。氯仿的作用？氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中）用酚－氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。为什么用无水乙醇沉淀DNA？用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。因而也可改用95％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95％乙醇昂贵）。但是加95％的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置15－30分钟即可。用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl或NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。CTAB法提取植物基因组DNA原理这种方法是由Murray和Thompson（1980）修改而成的简便方法。CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3mol/LNaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖类物质分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。DNA提取常见问题DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质。DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应，DNA中残留有金属离子，有RNA的存留。对策：重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质，重新沉淀DNA，让酒精充分挥发，增加70%乙醇洗涤的次数(2-3次)，加入RNase降解RNA。（1）DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。DNA提取常见问题：材料不新鲜或反复冻融、未很好抑制内源核酸酶的活性、提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断，外源核酸酶污染反复冻融。尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融，液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液。在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量，细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔。所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌。将DNA分装保存于缓冲液中,避免反复冻融。（2）DNA降解，DNA提取常见问题。实验材料不佳或量少，破壁或裂解不充分，吸附或沉淀不完全，洗涤时DNA丢失。尽量选用新鲜(幼嫩)的材料，动植物要匀浆研磨充分；G+菌，酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁。高温裂解时，时间适当延长(对于动物细胞,细菌可增加PK的用量)。增加吸附的时间、或低温沉淀小心操作。要用冰冻材料提出高质量的基因组DNA，应确保以下几点：1.确保采样后立即投入液氮中保存.2.在磨样时一定要一直使材料处于低温状态。研磨前先将液氮倒入研钵，研钵彻底冷却后，再放入材料，研磨过程中，一定不要让液氮挥发净使材料回温！否则会DNA降解得很厉害。装管的时候，