实验报告细胞色素C的提取

实验报告细胞色素C的提取一、实验目的1、熟悉细胞色素C提取与检测方法；2、掌握吸附、盐析、透析等实验技术。二、实验原理细胞色素C是以一种铁卟啉为辅基的呼吸酶，广泛存在于所有的需氧组织中。在心肌与其他做剧烈运动的肌肉中含量最为丰富。细胞色素C位于线粒体的蛋白质—脂质络合物中，分子量约为13000，肽链中含有19个赖氨酸残基，为一碱性蛋白,等电点（10.5~10.8）高、易溶于酸性溶液,故采用酸化水提取。人造沸石为铝酸钠，它是一种阳离子交换剂，细胞色素C分子刚好进入它的表面空隙。在pH7.5时细胞色素C呈正电荷，它可与沸石分子上的钠离子发生交换，从而被沸石吸附。装入层析柱后，用25%硫酸铵洗脱，又可将细胞色素C交换下来。硫酸铵主要是降低沸石对细胞色素C的亲和力。硫酸铵盐析可明显提高细胞色素C纯度，主要为去除杂蛋白。另外三氯乙酸可引起细胞色素C变性和聚合，必须严格控制三氯乙酸用量。三、实验仪器设备与材料试剂1、设备：组织捣碎机、酸度计、离心机、分光光度计、层析柱、透析袋、磁力搅拌器、冰箱2、仪器：剪刀、烧杯、漏斗、滤纸、天平、玻璃棒、纱布、试管、胶头滴管3、试剂：联二亚硫酸钠、硫酸、硫酸铵、三氯乙酸、人造沸石、氯化钡、氯化钠、氢氧化铵4、材料：新鲜猪心（2个）四、实验技术路线预处理水、硫酸、PH3.4新鲜猪心匀浆提取液氨水、pH6.0、过滤氨水、pH7.5、过滤滤液人造沸石水、氯化钠、硫酸铵硫酸铵盐析洗脱液滤液20%的三氯乙酸沉淀、离心、透析细胞色素C粗品溶液五、实验步骤1、预处理：健康猪心去脂肪等结缔组织—→剪碎放入碎冰中（保护酶的活性，避免捣碎机破碎时使酶失活）—→放入生理盐水中清洗去污—→称重：烧杯80g，烧杯＋猪心=240g，（240-80）×1.5=240ml酸化水—→组织捣碎机匀浆10min（匀浆3min，停5min，为了保证捣碎机安全）2、提取：搅拌后静置2h—→四层纱布过滤后加入1.5倍酸化水于沉淀物中，在过滤后静置2h—→放入冰箱保存过夜—→从冰箱中取出—→加2mol/L氨水调PH至6.0，静置30min，过滤—→滤液加2mol/L氨水调PH至7.5，静置30min,过滤3、吸附：加10%人造沸石（滤液为220ml）—→磁力搅拌器搅拌吸附1h—→蒸馏水洗3次—→0.2%NaCI溶液洗3次—→滤出人造沸石待用4、洗脱：在柱中装人造沸石体积的三分之二蒸馏水—→将沸石放入柱中—→装满25%硫酸铵溶液进行洗脱，流速控制在2ml/min以下,收集红色的洗脱液（没分辨出红色液体阶段，收集了所有洗脱液）5、盐析：在洗脱液（300ml）中慢慢加入固体硫酸铵75g,边加边搅拌，使硫酸铵溶液的浓度为50%—→置4℃冰箱过夜—→过滤，收集滤液—→向过滤液中按22ml/L的量滴加浓度为20%的三氯乙酸溶液（过滤液和20%三氯乙酸溶液最好在4℃遇冷,边加边搅拌,加时要快,防止局部蛋白质变性）—→加完后分成8管，立即离心—→无明显沉淀，再5000转离心15min—→无明显沉淀，向每只离心管加入2滴浓度为20%的三氯乙酸溶液—→再5000转离心15min—→无明显沉淀，实验结束6、透析将上述溶解后的细胞色素C装入透析袋中,放进500ml烧杯中（用磁力搅拌器搅拌），用去离子水透析,除去硫酸根离子，15min换水一次，换手3~4次后，检查硫酸根离子是否已被除尽。检查方法：取2ml氯化钡溶液加入试管中，滴加2~3滴透析外液至试管中，若出现白色沉淀，表示硫酸根离子未除尽，如果不出现沉淀，表示透析完全。将透析液过滤，收集滤液即为细胞色素C粗品。记录此粗品的体积。7、检测浓度检测：细胞色素C粗品是还原型和氧化型两种产品的混合物,在测定含量时,要加入联二亚硫酸钠,使混合物中的氧化型转变为还原型，还原型细胞色素C水溶液在波长520nm处有最大吸收值，根据这一特性，用分光光度计选一标准品，作细胞色素C的浓度和对应的吸光值的标准曲线，然后根据所测溶液的吸光值，由标准曲线求出所测样品的含量。具体操作：标准曲线的制定：取适量细胞色素C标准品，用蒸馏水稀释至10ml，从中取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0ml，分别放入5支试管中，每管补加蒸馏水至2ml，并加入少许联二亚硫酸钠作为还原剂，然后在520nm波长处测得各管的吸光值。以上述标准样品的毫升数为横坐标，吸光值A为纵坐标绘制出标准曲线。样品中细胞色素C含量的测定：取样品1ml，再加少许联二亚硫酸钠，然后在波长520nm处测得A值（做两个平行样品，取平均值），根据此A值查标准曲线，换算得到细胞色素C的浓度。纯度检测：因为细胞色素C属蛋白质，所以利用聚丙烯酰胺凝胶电泳来检测所的样品分子量大小以及纯度，从而评价所的样品的质量。具体操作：预先配置聚丙烯酰胺凝胶，样品和标准品分别混合缓冲液点样，再点上标准屏，在恒定电压作用下，达到分离的目的。后用考马斯亮蓝染液对蛋白质进行染色，后同脱色液脱去多余染液，得到电泳图。六、实验结果与讨论1、检测结果：原液配置：精密称取细胞色素C8.1微克，溶解于10毫升水，浓度0.81微克/毫升线性浓度0.10.20.40.60.81.0实际浓度0.04050.0810.1620.2430.3240.405吸光度0.04280.08160.15130.21970.29250.3599A组：吸光度：0.0136浓度：0.0145微克/毫升B组：吸光度：0.0099浓度：0.0131微克/毫升电泳检测结果：2、讨论从标准曲线图中可以看出，细胞色素C的浓度与一定条件下的吸光度成正比。在结果的电泳图中，清楚地可以看出标准品的浓度。而A组合B组显示结果中并无细胞色素C。说明本次实验提取浓度过低或提取失败。失败的原因可能是：实验方案不可行、浓度过低和实验操作步骤错误等。