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实验教学教案首页本次实验项目：动物肝脏DNA的提取及检测本次实验课时：10学时实验类型：综合性教学要求：1．掌握实验原理2．知道提取DNA要去除的物质，各步操作要规范，能够提取出DNA。3．掌握琼脂糖凝胶电泳的实验操作技术重点：各步操作要规范，能够提取出DNA。能够用电泳方法检测出所提的DNA。教学手段及教具：课堂讲授，学生实验操作。讲授内容及时间分配：课堂讲授1．相关知识…………………………………………………………………0.1学时2．实验目的……………………………………………………………………0.3学时3．实验原理……………………………………………………………………0.3学时4．实验操作………………………………………………………0.3学时实验教学动物肝脏DNA的提取及检测实验的操作技术……………………………9学时参考资料《分子生物学实验》综合性、设计性实验基本信息表学院名称生物科学与工程学院实验室名称生物化学实验室课程名称生物化学面向专业生物科学、生物技术实验名称动物肝脏中DNA的提取及检测大纲规定学时数10实验性质及依据实验性质（√）□综合性√□设计性实开学时数10实验目的：根据教师提供的实验条件，了解并掌握提取基因组DNA的原理和技术。能够从动物肝脏中提取DNA粗品，并能够用琼脂糖凝胶电泳法检测所提DNA。对实验结果做出正确定的分析。实验要求：1．根据教师给准备的实验材料、实验仪器和试剂，结合实验目的进行整个实验过程在实验前做好预习；2．做好每步实验结果的记录，根据原始记录，对实验结果做出正确分析，写好实验报告；写出本实验成功与失败的原因。实验内容：第一部分：动物肝脏中DNA的提取第二部分：DNA琼脂糖凝胶电泳认定依据：本实验内容所涉及本课程综合知识包括以下几方面：1.蛋白质变性作用、变性剂和酶的抑制剂。2.细胞膜蛋白的裂解、核蛋白体的解离。3.EDTA、SDS、蛋白酶K的作用。4．DNA的理化性质、DNA片段的大小表示方法、DNA与染料分子EB的结合。5.琼脂糖凝胶浓度的选择及配制。6．电泳知识及影响电泳样品迁移率的因素。实验项目设计人签字：李敏2007年5月10日专家组认定意见专家组组长：年月日学院意见盖章年月日职能部门意见盖章年月日动物肝脏DNA的提取及检测（综合性）相关知识1．蛋白质变性作用，变性剂和酶的抑制剂2．EDTA、SDS、蛋白酶K的作用、DNA的理化性质：溶解特性３．影响电泳迁移率的因素４．核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系琼脂糖浓度与DNA分离范围琼脂糖浓度0.30.60.70.91.21.52.0线状DNA大小/kb5-601-200.8-100.5-70.4-60.2-40.1-3５．核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系不同构型DNA的移动速度次序为：共价闭环DNA＞直线DNA＞开环的双链环状DNA。６．琼脂糖凝胶电泳的特点天然琼脂（agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（agarose，约占80%）及琼脂胶（agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷，而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，其优点如下。①琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可以进行电泳。②琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占98%~99%），近似自由电泳，样品扩散较自由电流，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。③琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测及定量测定。④电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。７．常用染料EB（溴化乙锭EthidiumBromide，EB）：溴乙锭染料全名是3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴盐，是诱变剂，可与核酸结合，在紫外光下呈黄色荧光。使用时一定要戴手套。EB废液要经过处理才能丢弃。①在300nm波长的紫外光照射下发出荧光。在适当的下，荧光强度与DNA片段的大小(或数量)成正比。可插入碱基与碱基之间造成移码突变。DNA（RNA）定量分析：可用紫外光谱分析，原理是DNA（RNA）分子在260nm处有特异的紫外吸收峰，且吸收强度与DNA(RNA)的浓度成正比。此外，还可通过琼脂糖凝胶电泳上显示的DNA（RNA）带的亮度来分析，因为EB作为一种荧光染料，能插入DNA(RNA)的碱基对平面之间而结合于其上，在紫外光的激发下产生荧光，DNA(RNA)分子上EB的量与DNA分子的长度和数量成正比。在电泳时加入已知浓度的DNA（RNA）Marker作为DNA（RNA）分子量及浓度的参考，样品DNA(RNA)的荧光强度就可以大致表示DNA（RNA）量的多少。８．提纯的思路①基因组DNA的特性：分子量较大、所提取的DNA片段的大小：100—150kb，易断（如何保证DNA分子的完整性？）②组织和细胞的破碎③要去除的物质：蛋白、多糖、脂类、RNA和小分子物质第一部分动物肝脏DNA的提取一、实验目的通过本实验了解并掌握提取基因组DNA的原理和技术。二、实验原理在EDTA和SDS等去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提，可以得到哺乳动物基因组DNA，用此方法得到的DNA长度为100－150Kb，适用于Southern杂交、基因组DNA文库的构建，酸性条件下DNA溶于有机相。碱性条件下（7~8以上）溶于水相。三、实验仪器、材料和试剂材料：鸡肝试剂：1．5mol/LNacl2．0.5mol/LTris.HClpH8.03．0.5mol/LEDTApH8.04．3mol/LNaAcpH5.2以上均高压灭菌5．蛋白酶K：10mg/ml配好后用一次性过滤器过滤，－20度保存6．组织匀浆液100mmol/LNaCl,10mmol/LTris.HCl（pH8.0），25mmol/LEDTA（pH8.0）7．酶解液：200mmol/LNaCl,20mmol/LTris.HCl（pH8.0），50mmol/LEDTA（pH8.0），200ug/ml蛋白酶K，1%SDS。8．无DNA酶的RNA酶：将胰RNA酶溶于100mmol/LTris.HCl（pH7.5）、15mmol/LNaCl溶液中，浓度10mg/ml，于100度水浴处理15分钟以降解DNA酶，缓慢冷却到室温，－20度保存。9．TE缓冲液10mmol/LTris.HCl（pH8.0），1mmol/LEDTA（pH8.0）10．平衡酚（pH8.0）：氯仿：异戊醇＝25：24：1（体积比）10.氯仿：异戊醇＝24：1（体积比）11.5×TBE5.4gTris,2.75g硼酸，2ml0.5mol/LEDTA（pH8.0），加水到100ml12.6×上样缓冲液0.25%溴酚蓝，40%（W/V）蔗糖水溶液13.DNA相对分子质量标准片段（bp）。四、实验操作步骤0.3g（0.2g）鸡肝，（冰冷生理盐水洗3次），剪碎(速度要快)碎鸡肝转入预冷的玻璃匀浆器中，加入2mL匀浆液（含EDTA），匀浆（低温操作，至少5－6次，直到无大块的组织存在）匀浆液转入2mL小离心管（转管前先静置一会，防止未碎的大块的组织进入2ml管）40C,5000rpm离心1~2min（离心要平衡，对称）弃上清，沉淀（细胞）加0.4mL无菌水，用枪吹散，再加0.4mL酶解液（含SDS、蛋白酶K）慢慢颠倒混匀，55℃水浴酶解2-3小时，直到酶解液彻底清澈（加RNase,终浓度200ug/mL，370C保温60min,可省略）加等体积酚/氯仿，（取下层液）慢慢颠倒混匀，冰上平倒静置10min40C，10000rpm离心10min试管中液体分三层：水相、蛋白层、有机相用钝化枪头小心取出上清水相（水相中含有DNA丝状粘稠）入另一新1.5小试管中注意不要取到蛋白上清加1/10体积的3mol/LNaAc（pH5.2？）和2倍体积的无水乙醇慢慢混匀，冰上（-20℃）静置30min以上（析出DNA，观察丝状物）40C，8000rpm离心10min沉淀用1mL70%冷乙醇洗1-2次，每次8000rpm离心10min，弃上清离心管中开盖，超净台中干燥沉淀加20-100uLTE,40C溶解（可根据沉淀量确定加TE的量）问题：各步操作所用试剂的作用及结果现象？操作方法注意事项？第二部分DNA琼脂糖凝胶电泳一、实验目的通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。二、实验原理DNA在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。核酸为两性分子，在PH3.5时，整个分子带正电；PH8左右时，碱基几乎不解离，整个分子带负电。在碱性环境下，不同的核酸分子由于具有相同的磷酸戊糖结构，几乎具有相同的电荷密度，相同碱基数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应即DNA分本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。三、仪器、材料与试剂（一）仪器电泳仪、平板电泳槽、样品槽模板（梳子）、橡皮膏、锥形瓶（100ml或50ml）、紫外分析仪、照相机或凝胶自动成像仪、一次性塑料手套、Eppendorf管（1.5ul）、微量移液器、量筒、微波炉。（二）材料自已提取的DNA，相对分子质量标准品（三）试剂1．5×TBE储液(PH8.0)每升含Tris54g，硼酸27.5g，0.5mol/LEDTA20ml，使用时稀释10倍成0.5×TBE（1×TBE也可）。2．6×凝胶加样缓冲液0.2%溴酚蓝，50%蔗糖，10mol/LNaOH1~2滴，调至蓝色。３．10mg/ml溴化乙锭溶液（EB），4℃保存。用时稀释成0.5ug/ml的EB。四、实验操作步骤1．琼脂糖凝胶的制备（配制浓度依照所提DNA的大小来确定，0.8%）配0.8%的胶，称到一定量的琼脂糖，放入锥形瓶中，加入25ml0.5×TBE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化取出摇匀，得一定浓度。等琼脂糖凝胶溶液冷却至50℃。加入EB液（3ul，原液10mg/ml）。2.凝胶板的制备3．加样（样品总体积在10~30ul）待测DNA中和DNA标准样品中分别加入1/5体积的溴酚蓝指示剂，混匀用移液器加入加样孔。4.电泳电压选择为80~120/cm，溴酚蓝移动到距胶板正极端约1cm时停止电泳。5.结果观察在254nm紫外光灯下（300nm紫外灯下）五、实验结果与讨论1．根据观察结果，按比例绘出凝胶图谱，并注明观察到的DNA亮带。2．判断所提DNA是否完整，如果断裂或者弥散，分析是在哪些步骤出现的问题。3.提DNA及电泳过程都遇到哪些问题，有哪些是在操作中应该注意的。六、注意事项思考题1.各步骤及所加试剂的作用及结果现象2．核酸的变性？核酸的理化性质