实验进展汇报

实验进展汇报一．实验名称：军牧1号白猪、杜洛克猪和小型猪核心群氟烷、LPIN1和H-FABP基因的连锁分析二．军牧1号白猪、杜洛克和小型猪概况军牧1号白猪由中国人民解放军军需大学(现为吉林大学农学部)1998年利用杂交育种原理，将比利时施格猪的臀部特别突出性状与三江白猪的繁殖性能好、适应性强等优良性状有机结合，通过继代选育方式，横交固定，自群繁育5个世代培育成的。杜洛克原产于原产于美国东部的新泽西州和纽约州等地，主要亲本用纽约州的杜洛克和新泽西州的泽西红杂交育成，原称杜洛克泽西，后简称杜洛克。小型猪，又称minipig，小型猪是生物医学研究中应用最为广泛的非啮齿类大型实验动物之一，具有其它实验动物不可替代的优越性，而且作为异种器官移植最可能的供体成为研究热点。三．实验所选的主要基因3.1氟烷基因1974年，Christian报道了用氟烷麻醉剂可以诱导猪PSS，因此控制PSS的基因称为氟烷基因(Hal)或兰尼受体基因(RYR1)。Minkema(1976)、Marry(1981)、Smith(1977)等提出，氟烷敏感性状由一对基因HalN和Haln控制，N对n表现为显性。进一步研究表明，发现PSS是因兰尼受体基因(Ryanodine,Receptorgene，RYR1)突变所致，即兰尼定受体cDNA中的C1843-G突变为T1843-A，使受体蛋白第615位精氨酸变为半胱氨酸，从而导致结构和功能的改变。3.2LPIN1基因脂素基因(LPIN)是新近发现的双向调控身体脂肪的一个基因家族，其蛋白产物称为脂素(lipin).Lpin1的缺乏会阻止正常的脂肪发育，并显著的减少脂肪团块的出现。而当Lpin1在骨骼肌或脂肪组织中过表达时，会加剧小鼠的肥胖。猪LPIN1基因位于3q21-27，其编码区为2685bp，编码894个氨基酸。人、大鼠、小鼠和猪这4个物种的lipin1间的两两蛋白质序列相似性为88.18%~96.43%。猪LPIN1基因上已鉴定发现了17个SNP。其中有5个SNP位于内切酶的酶切位点上。分别是：位于外显子2上的T60C，该位点上的T-C转换造成了TaqI限制性内切酶酶切位点（T*CGA）的获得和丢失。与眼肌面积、板油率和肌内脂肪含量存在显著相关。位于外显子20上的T159A的T-A碱基转换造成了Eco88I限制性酶切位点（C*YCGRG）的丢失和获得。与眼肌宽、眼肌面积、板油率和失水率存在显著相关。位于外显子20上的C243T的C-T碱基颠换造成了Bsh1236I限制性酶切位点（CG*CG）的获得和丢失。与屠宰率、臀中肌中点背膘宽、6－7肋间膘宽、眼肌高、眼肌宽和板油率存在显著相关。位于外显子20上的C2040T的C-T碱基颠换造成了TaqI限制性酶切位点（T*CGA）的获得和丢失。与眼肌高、眼肌面积和滴水损失存在显著相关。位于外显子20上的G1975A的G-A碱基颠换造成了PstI（CTGCA*G）限制性酶切位点的获得和丢失。与眼肌高、眼肌宽、眼肌面积、腿臀肉骨率和滴水损失存在显著相关。本实验将选择位于外显子20上的T159A的Eco88I限制性酶切位点和C243T的Bsh1236I限制性酶切位点的多态性进行研究。3.3H-FABP基因H-FABP，又称FABP3，是FABP家族中最普遍的一种类型，主要在对脂肪酸高度需求的组织，如心肌、骨骼肌和乳腺中表达，主要作用是协助细胞内脂肪酸转运到特定的细胞器或者细胞膜中，保护细胞膜和酶，调整某些酶类的底物浓度，在心肌和脂肪细胞中沉积甘油三酯。脂肪酸结合蛋白属小分子细胞内蛋白，参与细胞内脂肪酸运输，主要功能是将脂肪酸从细胞膜运送至脂肪酸氧化和甘油三脂及磷脂的合成部位。猪H-FABP基因位于6号染色体，由1.6kb的上游调控序列、0.2kb的3’-端非翻译区、4个外显子(分别编码含24、58、34、17个氨基酸的多肽片段)和3个内含子(4.2、2.3、1.5kb)组成。猪H-FABP基因存在MspⅠ、HaeⅢ、HinfⅠ酶3个酶切多态位点，且H-FABP基因的纯合基因型aa/dd/HH与IMF含量呈显著正相关，因此可作为IMF含量的侯选基因。先前马焕的实验证实，在军牧1号猪的群体中，未发现有MspI酶切位点的多态性，故本实验仅对HaeⅢ、HinfⅠ酶切位点的多态性进行检测。3.4酸肉基因酸肉基因又叫RN基因(RendementNapolegene)，是LeRoy最先提出的,包括突变的显性基因RN和正常的隐性基因rn,位于15号染色体的p2.1～2.2区,周围有多个微卫星标记。RN位点是影响猪肉质加工性状RTN(“Napole”technologicalyield)的主效位点。RN基因对肉质有显著的影响,RN可使肌糖原含量升高70%,而使肌蛋白含量降低。肌糖原含量较高,糖酵解后产生的乳酸量较多,使肌肉的酸度增加。pH在下降后接近于肌肉中结构蛋白等电点,使肌丝之间空隙缩小,引起较低的系水力和较浅的肉色。先前马焕的实验证实，在军牧1号猪的群体中，酸肉基因全部为rn型，故本实验将不对酸肉基因进行多态性检测。四．试验研究的主要内容和方法1.选取军牧1号白猪、杜洛克和小型猪选种群体，并提取DNA；2.军牧1号白猪、杜洛克和小型猪氟烷，LPIN1和H-FABP基因的多态性分析；3.不同多态性基因型与胴体品质和肉品质相关性分析；4.不同多态性基因型的基因连锁分析；5.分析军牧1号白猪优良肉质性状与遗传因素间的统计学联系。实验动物来源于吉林大学原种猪场。在军牧1号白猪选种群体和杜洛克、小型猪群体中各选取50头选取健康的、28日龄断奶的仔猪，耳静脉采血后，在同一标准下饲养。进行血液采样，提取血中总DNA后，PCR扩增氟烷基因、LPIN1基因、心脏脂肪酸结合蛋白基因上特异性位点附近的DNA片段后利用酶切对扩增的多态性序列对进行多态性分析。进行多态性分析后，将基因分型，每一种基因型选取3头，待仔猪成年后，测定其胴体性状。将其与军牧1号白猪的生长和胴体性状进行相关连锁分析。并对得出的结果进行软件处理，分析其统计学联系。五．已完成的内容5.1第一阶段：1月24日――2月10日订购试剂，并对氟烷、酸肉和H-FABP的两段基因的多重PCR方法进行了摸索，成功的摸索出了合理的双重PCR体系。由于内切酶2月8日才送到，故没有进行酶切的实验，但在郭特、杨晶、刘昊和宋文飞同学的配合下，通过软件，对四段基因的酶切位点进行了详细的计算，并提出了一套初步的酶切方案。5.2第二阶段：3月7日――3月16日按照年前提出的方案，对氟烷、酸肉和H-FABP的两段基因的多重酶切进行了摸索，并取得了成功，成功的构建了针对氟烷、酸肉和H-FABP基因的多重酶切体系。5.3第三阶段：4月7日――现在由于赵老师和孙老师的意见，将没有多态性的酸肉基因和H-FABP基因的MspI酶切位点去掉，换为研究LPIN1基因的多态性和胴体性状的关系。在第二阶段的实验结束后，进行了一系列资料的查阅，期间遭遇刘博洋住院和本人食物中毒两件事，故有所耽搁，但还是在4月5日前完成了引物设计、多态性位点选择、酶切体系重新构建的一系列工作，并于4月7日清明节节后重新开始了实验工作，至4月20日止，已经成功摸索出了LPIN1基因的PCR方法，但因为凝胶回收失败，酶切没有成功。本阶段的其它工作是对LPIN1基因和二含子基因的双重酶切进行实验，并进行后续的酶切实验。本阶段全部工作预计将在4月23日前完成。5.4第四阶段：4月23日――6月初至此，摸索过程已经全部完成，将全力开始正式的实验工作，本阶段将对三种猪进行组织采样和DNA提取，并进行后续的双重PCR和双重酶切实验，由于有三名本科生需要毕业，在此阶段还将把实验结果运用到她们的毕业论文上。5.5第五阶段：8月初――10月所选取的猪已长大，将对猪进行屠宰并进行胴体性状测评，测评之后将进行连锁分析。此期间将进行开题报告的修改和开题答辩的准备工作，同时撰写论文。六．经费使用情况：（标明红色的为不必要的支出）时间商品单价数量金额1月21日DNTP801801月21日Taq酶6031801月27日引物合成227.52月4日Alw21l内切酶24012402月4日BsrBrl内切酶12011202月4日Hinfl内切酶12011202月4日Haelll内切酶961962月4日Mspl内切酶11211123月12日引物合成503月13日DNTP801803月13日Taq酶6031804月1日引物合成804月7日Eco88I内切酶19211924月7日Bsh1236I内切酶20012004月15日DNTP801804月15日Taq酶6031804月15日引物合成1004月15日引物合成117.54月20日引物合成50总计2485七．预计经费使用情况：DNA提取试剂盒：提取组织DNA用，大约需要两个，1600元；引物合成：目前所剩引物尚够，故如实验内容无变动，不需要再进行引物的合成；DNTP：做PCR需要使用，大约还需3管，240元；Taq酶：做PCR需要使用，大约还需要6管，360元；Alw21l内切酶：需要使用200次，每次0.5微升，大约还需要3管，720元；Hinfl内切酶：需要使用200次，每次0.5微升，大约还需要1管，120元；Haelll内切酶：需要使用200次，每次0.5微升，大约还需要2管，192元；Eco88I内切酶：需要使用200次，每次0.5微升，大约还需要1管，192元；Bsh1236I内切酶：需要使用200次，每次0.5微升，大约还需要3管，600元；总计还需要约4024元。