培养基资料

常用的配方是：亚硝化细菌培养基：硫酸铵0.5g氯化钠0.3g硫酸亚铁0.03g磷酸二氢钠1g硫酸镁0.03gCaCl27.5g蒸馏水1000mlPH7.5，固体培养基加5％琼脂硝化菌培养基：亚硝酸钠1g硫酸镁0.03g硫酸锰0.01g磷酸氢二钾0.75g无水碳酸钠1g磷酸二氢钠0.25g蒸馏水1000mlPH7.5，固体培养基加5％琼脂。另外如果是用固体培养基倒置培养，可以适当多加些琼脂。亚硝酸盐有毒，使用时要当心。亚硝化细菌18分钟可繁殖一代，硝化细菌大约要15小时繁殖一代。一般3-5天就会出结果，乳白色的菌落。亚硝化细菌用格里斯试剂检测(出现红色)，硝化细菌用二苯胺检测（出现蓝色）。第0天不呈蓝色;第1~3天,略微呈蓝色;第4天,蓝色明显加深;第5~8天,呈深蓝色,而空白对照二苯胺试剂检测结果一直不呈蓝色。活性污泥中的硝化细菌富集培养取得了预期结果,自养硝化细菌成为优势菌群。然后还要根据你的用途进行定向培育。肉汤培养基：牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，氯化钠0.5％，琼脂2％1.2实验方法1.2.1硝化细菌的分离将采集到的海水样本分别放在两个培养皿中，分别加入亚硝化菌液体培养基和硝化菌液体培养基，放在24℃地培养箱中培养5天，然后取培养液在固体培养基上进行分区划线，得到单菌落，再挑取单菌落进行分区划线分离。1.2.2形态结构鉴定（1）将分离得到的单菌落分别接种到肉汤培养基的平板上看其是否生长（硝化细菌是严格的自养菌，在肉汤培养基上不能生长）。（2）镜检观察：单染色法（3）在培养液中加入格利斯试剂，亚硝化菌培养液变红即可判断为阳性，硝化菌的培养液需比色计算出其亚硝酸根浓度是否降低，才能判断是否为硝化菌。1.2.3细菌的培养（摇瓶、发酵罐）（1）摇瓶培养：将初步鉴定是硝化细菌的菌落接种到摇瓶中20-28℃培养，200转/分钟，每隔五天取样一次测硝化作用强度和菌浓度。（2）发酵培养：将培养5天的种子加入发酵罐中，于20-28℃培养，其中pH控制在6.0以上。每隔12小时取样测亚硝酸根浓度和菌浓度。1.2.4硝化作用测定1.2.4.1试剂（1）格利斯试剂溶液Ⅰ：称取磺胺酸0.5g，溶于150ml醋酸溶液（30％）中，保存于棕色瓶中。溶液Ⅱ：称取α-萘胺0.5g，加入50ml蒸馏水中，煮沸后，缓缓加入30％的醋酸溶液150ml中，保存于棕色瓶中。（2）2%醋酸钠溶液将2g无水醋酸钠加入到100ml蒸馏水中，混匀溶解。1.2.4.2方法☆标准曲线的绘制①称取4.500g分析纯亚硝酸钠于干燥的小烧杯中，加蒸馏水溶解后洗入100ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度定容，摇匀，溶液中NO2-的浓度为30mg/ml，用时稀释至NO2-为0.03mg/ml。②吸取NO2-标准液（NO2-0.03mg/ml）0、1、2、3、4、5ml，分别放入50ml容量瓶中，每一容量瓶NO2-浓度为0、0.6、1.2、1.8、2.4、3.0μg/ml；各加入1ml格利斯试剂Ⅰ，放置10分钟，再加入1ml格利斯试剂Ⅱ和1ml2％醋酸钠溶液，显色后稀释至刻度。③用分光光度计于520nm处比色，以浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制标准曲线。☆培养液中NO2-测定①亚硝化菌氨转化作用测定取1ml培养液于50ml容量瓶中，加入1ml格利斯试剂Ⅰ，放置10分钟，再加入1ml格利斯试剂Ⅱ和1ml2％醋酸钠溶液，显色后稀释至刻度。用分光光度计于520nm处比色。②硝化菌硝化作用强度测定取1ml培养液稀释100倍（视培养液中NO2-浓度而定），取稀释后的培养液1ml于50ml容量瓶中，加入1ml格利斯试剂Ⅰ，放置10分钟，再加入1ml格利斯试剂Ⅱ和1ml2％醋酸钠溶液，显色后稀释至刻度。用分光光度计于520nm处比色。☆结果计算＠标准曲线以浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制标准曲线。回归得到方程y=ax+b＠亚硝酸根浓度=，mg/ml。d=稀释倍数1.2.5细菌浓度测定（1）取0.1ml培养液加到0.9ml生理盐水中，混匀，就得到10－1的菌悬液，再取出0.1ml加到0.9ml生理盐水中，得到10－2的菌悬液，同样方法依次稀释到10－3、10－4的菌悬液，具体情况视菌悬液浓度而定。（2）将稀释好的菌悬液取0.1ml，与冷却到50℃的琼脂培养基混匀，于24℃培养5天，进行计数。2.2硝化细菌的鉴定2.2.1形态结构鉴定—单染色法经单染色法观察，亚硝化菌为椭圆形球菌，体积较大；硝化菌体积较小。与文献所述相同。见图2和图3。将挑选出来的菌落接种到肉汤琼脂培养基上，没有生长，可以认为该菌为自养菌。硝化细菌是严格的自养菌不能在肉汤培养基上生长。2.2.3硝化作用鉴定将亚硝化菌和硝化菌接种到液体培养基中，于24℃培养5天，在亚硝化菌的培养液中加入格利斯试剂，溶液变红可以判断为亚硝化菌；将硝化菌的的培养液取出1ml稀释100倍，加入格利斯试剂，于752分光光度计上比色，看其中的亚硝酸根含量减少，可以断定为硝化菌。2.3氨转化作用和硝化作用2.3.1亚硝化菌的氨转化作用亚硝化菌经过5周的摇瓶培养能使培养液中亚硝酸根的浓度能上升到300μl/ml以上，说明其具有亚硝化作用。2.3.2硝化菌的硝化作用硝化菌经过10天左右的发酵培养可使发酵液中的亚硝酸根浓度下降40％左右。实验结果见图5。2.4硝化细菌的培养由于硝化细菌产酸，发酵罐中的pH值一直呈下降的趋势，但是由于酸性环境不利于硝化细菌的硝化作用，所以pH值最好控制在6.0以上。实验结果见图6。2.4.2发酵培养硝化细菌溶氧的变化硝化细菌是一种好氧的自养菌，由于硝化细菌生长速度缓慢，发酵液中的菌浓度一直较低，因此溶氧一直较高，最低时也有68％左右。在发酵后期随着菌体的自溶，溶氧还有上升的趋势。亚硝化细菌富集培养基：硫酸铵0.5g，磷酸二氢钾0.07g，七水硫酸镁0.05g，二水氯化钙0.05g，蒸馏水100ml，用5％碳酸钠调节pH为8。硝化细菌富集培养基：将上述培养基中硫酸铵替换为亚硝酸钾0.2g。硝化细菌分离培养基：A液：硫酸铵11g，七水硫酸镁1.4g，七水硫酸铁0.3g，蒸馏水100ml。B液：磷酸二氢钾1.36g，蒸馏水100ml。A、B液9：1混合，用0.1N的氢氧化钠调节pH8.0～8.2。氨氧化细菌培养基：（NH4)2SO40.6g，MnSO40.03gMgSO4·7H2O0.01g，Na2CO30.1g，NaH2PO40.75g，K2HPO40.25g反硝化细菌培养基：富集培养基(即反硝化选择性培养基):硝酸钾2g、硫酸镁0.2g、磷酸氢钾0.5g、酒石酸钾钠20g、蒸馏水1000mL;pH约7.2。分离培养基:在富集培养基中加入约1.8%的琼脂即可。纯化培养基:采用LB培养基将水样10mL加入到100mL的富集培养基中,30℃静置密闭培2d后,10倍稀释涂分离培养基平板,得到单菌落,多次经LB平板划线纯化,转入斜面保存。