基因工程之基因治疗

基因治疗摘要：生物技术在生命科学领域扮演者重要的角色，基因治疗在治疗方面，将新的遗传物质转移到某个个体的体细胞内使其获得治疗效果；在基因工程方面，将正常的有功能的基因置换或增补缺陷基因。近些年来，已对若干人类单基因遗传病和肿瘤开展了临床的基因治疗。基因治疗作为治疗疾病的一种新手段，正愈来愈受到人们的重视和关注。关键词：基因工程基因治疗基因一、基因治疗的历史随着DNA双螺旋结构的发现和以DNA重组技术为代表的现代分子生物学技术的发展以及人类对疾病认识的不断深入，越来越多的证据证明，多种疾病与基因的结构或功能改变有关，因而萌生了从基因水平治疗疾病的念头和梦想。早在1968年，美国科学家发表了“改变基因缺损：医疗美好前景”的文章，首次在医学界提出了基因疗法的概念。1989年美国批准了世界上第一个基因治疗临床试验方案。1990年美国NIH的FrenuchAnderson博士开始了世界上第一个基因治疗临床试验，用腺苷酸脱氨酶基因治疗了一位ADA基因缺陷导致的严重免疫缺损的四岁女孩，并获得成功[1]。1994年美国科学家利用经过修饰的腺病毒为载体，成功地将治疗遗传性囊性纤维化病的正常基因cfdr转入患者肺组织中。2000年，法国巴黎内克尔儿童医院利用基因治疗，使数名有免疫缺陷的婴儿恢复了正常的免疫功能，取得了基因治疗开展近十年最大的成功[2]。2004年1月，深圳赛百诺基因技术有限公司将世界第一个基因治疗产品重组人p53抗癌注射液正式推向市场，这是全球基因治疗产业化发展的里程碑[3]。迄今报道已有数千例基因治疗患者，病种主要是恶性肿瘤、艾滋病、血友病B、病毒性肝炎等等。二、基因治疗的概念基因治疗是指向有功能缺陷的细胞补充相应的基因，以纠正或补偿其基因缺陷，从而达到治疗的目的。广义的说，基因治疗就是应用基因或基因产物治疗疾病的一种方法。狭义的说，基因治疗是把外界的正常基因或治疗基因，通过载体转移到人体的靶细胞，进行基因修饰和表达，治疗疾病的一种手段。三、基因治疗应具备的条件1、选择适当的疾病，并对其发病原理及相应基因的结构功能了解清楚。2、纠正该病的基因已被克隆，并了解该基因表达与调控的机制与条件。3、该基因具有适宜的受体细胞并能在体外有效表达。4、具有安全有效的转移载体和方法，以及可供利用的动物模型。四、基因治疗的途径1、体外法（exvivo）在体外用基因转染病人靶细胞，然后将经转染的靶细胞输入病人体内，最终给予病人的疗效物质是基因修饰的细胞，而不是基因药物。2、体内法（invivo）直接将外源DNA注射到机体内，使其在体内表达发挥治疗作用。体内法比体外法更简单和经济，疗效也比较确切，常用的体内基因直接转移手段有病毒介导、脂质体介导和基因直接注射等。五、基因治疗方法1、基因置换用正常基因在原位替换致病基因，使细胞DNA完全恢复正常状态。2、基因修复将致病基因的突变碱基序列纠正，使正常部分予以保留。3、基因修饰又称基因填补。将目的基因导入病变细胞或其它细胞，目的基因的表达产物能够修饰缺陷细胞的功能或使原有的某些功能得以加强。4、基因失活利用反义RNA、核酸或肽核酶等反义技术及RNA干涉等能特异性地封闭基因表达的特性，抑制一些有害基因的表达，以达到治疗基因的目的。5、免疫调节将抗体、抗原或细胞因子的基因导入病人体内，改变病人免疫状态，从而达到预防和治疗疾病的目的。六、基因治疗的重要过程1、目的基因的选择和制备对于遗传病，只要已经研究清楚某种疾病的发生是由于某个基因的异常所引起的，其野生型基因可被用于基因治疗。对于病毒病，所选择的靶基因应在病毒的生活史中起重要的作用并且该序列是特异性的。确定目的基因后，多采用PCR等技术制备目的基因。2、靶细胞的选择选择靶细胞时要考虑：①细胞容易获得，并且生命周期较长；②最好是组织特异性细胞；③离体细胞较易受外源基因转化；④离体细胞经转化和一定时间培养后再植回体内，仍较易成活。常用的靶细胞有：造血细胞、皮肤纤维细胞、肝细胞、血管内皮细胞、淋巴细胞、肌肉细胞、肿瘤细胞等。许多遗传病与造血细胞有关，故可用于如β地贫、严重复合免疫缺陷病等的基因治疗。皮肤成纤维细胞易于移植和从体内分离，又可在培养中生长，并易存活，故有人用之于乙型血友病的基因治疗。有不少遗传病表现了肝细胞功能缺陷，因此，在家族性高胆固醇血症的治疗中，有将低密度脂蛋白（LDL）受体基因转移至肝细胞的尝试。在动物实验中已证明：β－半乳糖苷酶基因、ADA基因、小肌营养不良蛋白基因都已证明能在肌细胞中表达。生殖细胞基因治疗是指将正常基因转移的患者的生殖细胞或者早期胚胎，使其发育成正常个体。体细胞基因治疗是指将正常基因转移到体细胞，使之表达基因产物，以达到治疗目的。3、转移载体的选择与细胞转染转移载体分为两大类：病毒载体和非病毒载体。病毒载体必须具备的条件有携带外源基因并能包装成病毒颗粒；介导外源基因的转移和表达；对机体不治病。病毒载体包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体等。非病毒载体包括裸DNA、脂质体、多聚体、分子偶联体。非病毒方法有磷酸钙沉淀法、脂质体转染法、显微注射法等。基因转移的病毒方法中，RNA和DNA病毒都可用为基因转移的载体。常用的有反转录病毒载体和腺病毒载体。转移的基本过程是将目的基因重组到病毒基因组中，然后把重组病毒感染宿主细胞，以使目的基因能整合到宿主基因组内。将目的基因导入靶细胞的方法分为：病毒感染、显微注射、电穿孔、化学转染试剂等。4、外源基因的表达与检测在筛选出转化子后还需鉴定转染细胞中外源基因的表达状况。常用的方法有：原位杂交、Northern杂交、RNA打点杂交、免疫化学组织染色等。流式细胞仪是一种较为客观准确的仪器。可用于定量分析外源基因的表达状况。七、基因治疗的种类及应用1、遗传病的基因治疗1990年9月14日，对一位腺苷脱氨酶缺乏症的女童进行首例基因治疗。该病临床表现为严重的免疫功能低下，因为腺苷脱氨酶使淋巴细胞中脱氧腺苷脱氨成为脱氧肌苷，最后代谢为尿酸，排出体外。而该酶缺乏时，脱氧腺苷不能脱氨，在细胞内大量堆积，造成淋巴细胞死亡，机体免疫功能缺乏。虽然可以替换腺苷脱氨酶，但效果很有限。脐带血含有丰富的干细胞。目前，研究人员正在用取自脐带血液并改变了基因的干细胞，对三个刚出生不久的患有脱氨酶缺乏症的婴儿进行治疗。治疗过程如下：将病人麻醉后，取出病人的骨髓液，分离淋巴细胞；将淋巴细胞与携带有腺苷脱氨酶基因的逆转录病毒混合培养，经病毒感染使腺苷脱氨酶基因进入淋巴细胞；清洗淋巴细胞，去除多余的病毒。筛选鉴定淋巴细胞中腺苷脱氨酶基因的表达，将带有此基因的淋巴细胞输回到病人体内；密切观察病人各项免疫指标的变化。2、肿瘤基因治疗肿瘤的发生是由于某些元癌基因的激活、抑癌基因的失活及凋亡相关基因的改变从而细胞增殖分化和凋亡失调。针对肿瘤发生的遗传学背景，将外源性目的基因引入肿瘤细胞或其它体细胞内以纠正过度活化的基因或补偿缺陷的基因，从而达到治疗肿瘤的目的。3、病毒病的基因治疗以病毒性肝炎为例，其病原体是肝炎病毒，包括甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒。无论哪种病毒引起的急性或慢性病毒性肝炎，都是因为病毒基因的复制、表达、病毒抗原诱发机体的免疫病理反应而引起肝脏的炎症反应和损坏。所以治疗的根本方法是阻断、抑制甚至是清楚肝炎病毒。采用核酶、反义寡核苷酸、显性失活突变体等方式均可抑制HBV或HCV病毒的基因复制和表达。八、基因治疗所面临的问题基因导入系统缺乏靶向性，效率较低。以腺病毒为载体的p53基因转移治疗恶性肿瘤的方案中，只能直接将腺病毒注射到肿瘤局部。若静脉注射，病毒颗粒将很快被清除。真正能够到达肿瘤组织的很少，难以达到治疗效果，且增加了副作用。针对遗传性疾病的基因治疗方案大多数采用逆转录病毒载体，其插入或整合到染色体的位置是随机的，有引起插入突变及细胞恶性转化的潜在危险。而理想的基因治疗方案应该是在原位补充、置换或修复，或者将治疗基因插入到宿主细胞染色体上不致病的安全位置。理想的基因治疗应能根据病变的性质和严重程度不同，调控治疗基因在适当的组织器官内和以适当的水平或方式表达。但目前还不能达到这一指标。主要是因为现有的基因导入载体容量有限，不能包容全基因或完整的调控顺序，同时人们对导入的基因在体内的转录调控机理的认识有限。九、对基因治疗的展望基因治疗是21世纪医药领域的重大突破。随着分子病理学、分子生物学等相关学科的发展，治疗的策略日益丰富，其中许多方案已进入临床试验或实施阶段，成为临床上重要的辅助治疗手段。同时，治疗所针对的疾病也从早期的单基因遗传病扩展到肿瘤、病毒性疾病、心血管病等严重威胁人类健康的疾病。在基因导入载体方面出现了两大主流：一是非病毒载体系统;二是病毒载体系统。由于非病毒系统导入基因的效率相对较差，故在基因治疗临床试验中的使用率不到百分之二十;但非病毒载体的生物安全性较好，特别是靶向性的脂质体。靶向性的多聚物的出现结合电泳冲、超声等新技术，明显提高了导入效率和靶向性，是今后非病毒载体发展的重要方向[4]。基于同源重组和基因定点纠错原理，在DNA水平的原位修复是遗传性疾病基因治疗的理想措施[5]。作为生物技术发展的前沿，基因治疗为疑难杂症提供解决办法，为人类健康带来不可估量的利益。基因治疗的手段越来越多地应用到诸如病毒性传染病的疾病治疗。除此之外，基因治疗将多种疾病预防的有效措施之一。有研究发现腺相关病毒AAV8是目前最有效的基因传递载体，可高效地将外源基因传递到肌肉和心脏[6]。目前，基因治疗已经从盲目阶段进入了理想化阶段。尽管基因治疗仍存在安全性、伦理性等多种多样的问题，但我们相信，随着科学研究的深层次进行，随着人们知识水平的提高，以及基因治疗的普及，基因治疗必将会得到更加广泛、更加科学的应用。[参考文献]1、AndersonWF,BlaeseRM,CluverK,etal.TheADAhumangenetherapyclinicalprotocol:pointstoconsiderresponcewithclinicalprotocol.HumGeneTher,1990,1:331-3622、Cavazzana-CalvoM,Hacein-BeyS,deSaintBasileG,etal.Genetherapyofhumanseverecombinedimmunodeficiency(SCID)XIdisease,2000,288(5466):669-6723、PearsonS,JiaH,KandachiK.Chinaapprovesfirstgenetherapy.NatBiotechol,2004,22(1):3-44、El-AneedA.Anoverviewofcurrentdeliverysystemsincancergenetherapy.JControlRelease,2004,94:1-45、WuXS,LiuDP,LiangCC.ProspectsofchimericRNA-DNAoligonucleotidesingenetherapy.JBiomedSci,2001,8(6):439-4456、WangZ,ZhuT,QiaoCP.Adeno-assoiatedvirusserotype8efficientlydeliversingenestomuscleandheart.NatBiotechnol,2005,23(2):321-328