基因工程抗体演示文稿.

制作人：抗体研究的世代§第一代抗体:多克隆抗体（polyclonalantibody)§第二代抗体:单克隆抗体（monoclonalantibody，McAb)§第三代抗体:基因工程抗体（geneticengineeringantibody)McAb的一般过程(杂交瘤技术）优点：(1)在体外“永久”地存活并传代(2)特异性强、灵敏度高、产量大(3)适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法(4)可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗（二）单克隆抗体的优点与局限性局限性：固有的亲和性弱；反应强度不如多克隆抗体；制备技术复杂、费时费工、价格较高;基因工程抗体(Geneticengineeringantibody)基因工程抗体兴起于20世纪80年代早期。这一技术是在充分认识Ig基因结构和功能的基础上，应用DNA重组技术和蛋白质工程技术，根据研究者的意图，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体，也称第三代抗体。在此主要就嵌合抗体、改型抗体、噬菌体抗体进行介绍。（一）嵌合抗体从杂交瘤细胞基因组中分离和鉴别出功能性VL和VH基因，与人Ig恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，使之表达人-鼠嵌合抗体。嵌合抗体优点：§减少了鼠源性抗体的免疫原性§保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力（二）改型抗体尽管嵌合抗体的免疫原性已降低很多，但有时它仍可能引发较强的免疫反应。为了进一步降低抗体的鼠源成分，发展出CDR移植技术。即把鼠抗体的CDR序列移植到人抗体的可变区内，所得到的抗体称CDR移植抗体或改型抗体，也就是人源化抗体。特点：进一步减少嵌合抗体中的鼠源性成分，减弱可能发生的HAMA,但又具有鼠源性单抗特异性，有可获得人抗体亲和力的移植抗体。随着PCR技术的发展，利用基因工程的方法可将全套抗体V区基因克隆出来，并在噬菌体表面表达、分泌、经筛选后获得特异性抗体，这种技术称为噬菌体抗体库技术(phagedisplayantibodylibrarytechniques)。所构建的抗体库称为全套抗体库。利用这一技术可以得到完全人源性的抗体，而且从理论上讲，这种抗题库中可以筛选出任何一种抗体。因此，它的成功研制代表着基因工程抗体的前沿，是生命科学研究的重大突破之一。（三）噬菌体抗体库技术•原理：以噬菌体为载体，将抗体基因（Fab或scFv基因等）与噬菌体编码的外壳蛋白相连,导入宿主细胞，正确折叠后被包装与噬菌体尾部，随噬菌体表达，并释放出带有抗体的噬菌体。这种抗体可以特异性识别抗原，又能感染宿主进行再寄生。此技术的产生终于使人们有可能脱离体内系统，在体外制备特异性抗体。噬菌体抗体库的构建•该项技术的优点:§将抗体的基因型和表型紧密联系起来;§可绕过杂交瘤技术，不需要复杂的基因工程技术;§抗体基因筛选的范围广;§技术稳定、可靠、生产周期短;可规模化生产;§适用范围广，既可用于抗体制备，也适用于其它蛋白如激素、酶、随机多肽等的生产。一.在新型疫苗研制方面的应用•有报道表明，将白色念珠菌特异表位基因插入到修饰后的质粒载体中，制备了杂合噬菌体。利用纯化的该表位抗原PA免疫小鼠，结果表明：免疫后小鼠脾淋巴细胞在有、无佐剂的情况下均有明显增殖，未见明显的毒副作用。此法提示：用噬菌体展示某螳特异性抗原，可获得低价高效的T程疫苗。噬菌体展示技术作为一种新型技术，将成为有效的可以用来表达候选疫苗表位的工具。噬菌体抗体库技术的临床应用二、在临床检验方面的应用•目前，临床所用的体外诊断试剂盒的抗体基本上都来源于动物。相比之下用基因工程方法制备的人源单链抗体，不仅可以避免动物源性抗体非特异结合导致的本底高、血液动力学指标不稳定等缺点；且组织穿透力强，显像效果明显优于动物源性抗体，酶标的人单链抗体也在ELISA等检测中显示了令人满意的结果。三.在自身免疫疾病中的应用•许多自身免疫疾病的发生，是由于机体产生的高亲和力自身抗体借助自身抗体依赖性细胞毒性（ADCC)作用或激活补体系统等机制引起组织病变，如重症肌无力、乔本氏甲状腺炎等。研究这些自身抗体的分布、基因构建、遗传规律、产生机制以及相应自身抗原的性质，将有助于人类对自身免疫疾病的认识。目前用于研究自身抗体的方法有杂交瘤技术和噬菌体抗体库技术。相比之下，噬菌体抗体库技术具有容易操作、可以大量制备和抗体人源化等优点。目前发现的lgG类自身抗体有64株，其中有49株是通过噬菌体抗体库技术得到的嘲。可以预见，利用噬菌体抗体，将来有可能弄清自身抗体的作用机制以及B细胞在提高自身抗原方面的作用机制，为预防和治疗自身免疫疾病提供了有力工具。四.在心血管系统疾病中的应用•危害人类健康的许多严重疾病，如心肌梗死、脑梗死等，均与血栓形成密切相关，血栓形成性疾病的发病率和死亡率均较高。抗人纤维蛋白单链抗体分子量小，是抗体的最小活性单位；且组织穿透力强，体内滞留时间短，清除快，能集中针对目标组织，与放射性核素、效应分子结合，可用于血栓性疾病的定位诊断和导向溶栓治疗，有很好的应用前景五.在肿瘤研究中的应用•利用肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原筛选噬菌体抗体库，能够得到特异性人源化单链可变区抗体，具有体内造影诊断和免疫治疗的应用前景。研究表明，ScFv的穿透力是完整抗体的100多倍。放射自显影结果证实：ScFv能够均匀地分布于实体肿瘤的内部，而完整抗体只能浓集于血管周围。以ScFv为导向，连接毒素分子而制备的特异性杀伤肿瘤细胞的生物导弹近年来得到应用。六.在医学微生物领域中的应用•目前，噬菌体抗体技术在微生物领域内最成功的应用是对病毒性肝炎诊治，这也是该技术目前应用的热点之一。国内已经有利用噬菌体抗体库筛选人抗各型肝炎病毒的人源可变区单链抗体的报道，这些人源可变区单链抗体的获得为肝炎的临床诊断、基因治疗、发病机制的研究，提供了有效的分子工具。此外，补给外源抗病毒的抗体，对一些致病机理相对复杂的病毒具有中和、杀伤的作用，可能为这些疾病的治疗打开僵局。如爱滋病的治疗方面，很多学者以HIV外壳糖蛋白gpl20为抗原，制备基因工程抗体IⅫ，实验证明可以干扰免疫缺陷病毒的组装；七.其他方面的应用•噬菌体抗体库技术除以上各方面的应用外，还可以用于药剂学研究中的靶向给药治疗，以其为基础的免疫毒素单克隆抗体，具有良好的稳定性，克服了鼠单抗穿透力差、致敏性高的问题；还有人把它用于筛选抗猪脂肪细胞膜抗体上，希望能减少动物体内过多的脂肪；噬菌体抗体库技术，还可以用于基因和蛋白质相互作用的分析药物的高通量筛选等方面的研究。已批准上市的单抗适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段移植排斥大肠癌冠心病淋巴瘤移植排斥炎症性肠病、类风湿CD317-1A血小板受体ⅡbⅢaCD20CD25TNF-аOKT3PanorexReoProRituxanSimulectRemicade鼠单抗鼠单抗人－鼠嵌合抗体人－鼠嵌合抗体人－鼠嵌合抗体人－鼠嵌合抗体19861995(德国)1994199719981998、1999适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段移植排斥乳腺癌RVS感染AMLCLLCD25HER-2RSVF蛋白CD33CD52ZanapaxHerceptinSynagisMylotargCAMPATH人源化抗体人源化抗体人源化抗体人源化抗体－化疗药物交联物人源化抗体19971998199820002001正在进行临床开发中的基因工程抗体(部分）适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段风湿性关节炎Complement(C5)TNF-аTNF-аTNF-аCD4CD45G1.1D2E7CDP870InfliximabIDEC-151MDX-CD4HumanizedHumanHumanized(Fab)Chimeric(IgG1)(嵌合)Primatized(IgG1)Human(IgG)ⅡⅢⅡFDA批准（1999）ⅡⅠ适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段自身免疫出血性病症气喘/变态反应CD64(FcgR)IL-5IL-5IL-4IgECD23MDX-33SCH55700SB-240563SB-240683rhuMab-E25IDEC-152HumanHumanized(IgG4)HumanizedHumanizedHumanized(IgG1)PrimmatizedⅡⅡⅡⅡⅢⅠ适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段移植物抗宿主疾病同种异体移植排斥CD147CD2CD2CD3CD3ABX-CBLBTI-322MEDI－507Orthoclone/OKT3SMATanti-CD3Murine(IgM)(小鼠)Rat(IgG)(大鼠)HumanizedMurine(Ig2a)HumanizedⅢⅡⅠ/ⅡFDA批准（1996）Ⅰ/Ⅱ适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段同种异体移植排斥中风青光眼抗凝血剂CD40LCD18ß2-integrinTGF－ß2FactⅦAntovaAnti-LFA-1LDP-01CAT-152CorsevinMHumanized(IgG)Murine[F(ab’)2]Humanized(IgG)HumanChimeric(Fab)Ⅰ/Ⅱ(继续)ⅢⅠ/ⅡаⅡⅠ适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段艾滋病乙型肝炎巨细胞病毒中毒性休克一般癌症Gp120HepBCMVTNF-аCD14VEGFPRO542OstavirProtovirMAK-195(SEGAND)IC14Anti-VEGFCD4fusionHumanHumanMurine[F(ab’)2]?Humanized(IgG1)ⅡⅡ(批准)ⅢⅢⅠⅢ适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段乳腺病慢性淋巴细胞白血病急性粒细胞白血病非何杰金淋巴瘤HER2/neuCD52CD33CD20CD22HerceptinCampath1/(LDP03)SmartRituxanLymphoCideHumanized(IgG1)Humanized(IgG1)M195Chimeric(IgG1)Humanized(IgG)FDA批准（1998）生物制品许可申请蛋白质设计FDA批准Ⅰ/Ⅱ•噬菌体抗体库技术是近20年发展起来的一种制备抗体的新技术。由于噬菌体抗体分子量较小，组织穿透性强，能够迅速到达靶抗原部位，在对多种疾病的诊断及治疗中有很强的应用价值。噬菌体抗体的生产工艺简单、费用较低，因而适用于大规模的生产。但是，目前噬菌体抗体库技术也存在一些问题：（1）构抗体库的容量将受到转化效率的限制。（2）目前所能构建得噬菌体抗体库最大容量为1010左右，而构建这样大的库容量常需耗费大量劳力。（3）候选抗体分子可能会丢失。（4）体内于体外之间重复转换的操作耗费大量人力。（5）由于噬菌体抗体分子量小，在体内分解过快，使其在实际肿瘤治疗中的应用受到了限制等问题。展望•尽管噬菌体抗体库技术还存在一些问题，但是随着噬菌体抗体库技术的不断完善和发展，相信这些问题都能得到很好的解决，噬菌体抗体技术在人类疾病的诊断及治疗中将有广阔的应用前景。EndThanks!