基因工程课程知识复习

第一章绪论(geneengineering)基因工程基因工程四大要素：供体基因；载体；工具酶；受体细胞技术上的三大发明：限制性核酸内切酶，连接酶，载体基因工程操作的基本过程Boyer-Cohen实验--基因工程的诞生第二章基因工程的酶学基础限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease，RE）II型限制性核酸内切酶（IIrestrictionendonuclease，RE-II）影响限制性核酸内切酶活性的因素星号活性（Staractivity）导致星号活性的因素连接酶Ligase第三章基因工程载体载体（vector)克隆载体（CloningVector）表达载体(Expressionvector)表达载体应具有的三个基本条件（启动子、核糖体结合位点（SD序列）和终止子）表达载体的表达方式（组成型表达、诱导型表达、融合型表达、分泌型表达）质粒（plasmid）（装载量范围在0-10kb之间）理想的克隆载体应具备的特性质粒的命名规则pBR322的优点①双抗生素抗性选择标记②分子量小，克隆能力大（可以携带6-8Kb的外源DNA）③拷贝数高④操作安全⑤具有较多的单一酶切位点pUC质粒的优点①分子量小，拷贝数高②MCS（多克隆位点）③双功能检测特性pBR322和pUC18/19质粒插入外源基因后筛选重组子的方法与原理菌落蓝白斑筛选的原理α-互补(Alphacomplementation)柯斯质粒（cosmid）λ-噬菌体载体的构建（野生型-DNA改造策略为理性克隆载体的策略）噬菌粒(phagemid)柯斯质粒(cosmid)（装载量范围在10-50kb之间）噬菌粒(phagemid)（装载量范围在10-50kb之间）酵母人工染色体（YAC）（装载量范围在350-400kb之间）细菌人工染色体（BAC）（装载量范围在50-300kb之间。）Ti质粒（Tiplasmid）双元表达载体第四章基因工程的主要技术及其原理核酸纯度评价琼脂糖凝胶电泳的常用指示剂（溴酚蓝、二甲苯青FF）和染色剂（EB）分子杂交（molecularhybridization）探针（probe）SouthernblottingSouthern杂交的基本原理和步骤Northern杂交的基本原理和步骤Southern杂交与Northern杂交有什么不同?菌落原位杂交的原理和步骤PCR技术的基本原理Primer引物PCR引物设计的原则或要求逆转录PCR（RT-PCR）Sanger双脱氧链终止法测序的原理基因定点诱变的方法（盒式诱变、寡核酸引物诱变、PCR诱变）用于研究DNA与蛋白质互作分析的主要技术方法及原理（其中重点是凝胶阻滞试验和DNaseI足迹试验的基本过程）第五章目的基因的获得获取目的基因的途径cDNA末端快速扩增（RACE）基因组文库（GenomicLibrary）理想基因组文库具备的条件文库最小值:N=ln(1-P)/ln(1-f)基因组文库的构建流程（以λ噬菌体载体为例）cDNA文库（cDNALibrary）cDNA文库的构建流程（以λ噬菌体载体为例）从总RNA分离获得mRNA的方法（磁珠结合法、纤维素亲和层析法）差异显示PCR（DDRT-PCR）的原理（传统mRNA差异显示技术（DDRT-PCR）是根据绝大多数真核细胞mRNA3'端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）结构，因此可用含oligo（dT）的寡聚核苷酸为引物将不同的mRNA反转录成cDNA。根据PolyA序列起点前2个碱基除AA外只有12种可能性的特征，设计合成了12种下游引物，称3′-锚定引物，其通式为5'-T11MN；同时为扩增出polyA上游500bp以内所有可能性的mRNA序列，在5′端又设计了20种10bp长的随机引物。这样构成的引物对进行PCR扩增能产生出200条左右的DNA条带，其中每一条都代表一种特定mRNA种，这一数字大体涵盖了在一定发育阶段某种细胞类型中所表达的全部mRNA。将PCR扩增产物电泳后凝胶上形成的差别表达条带中的DNA回收，扩增至所需含量，进行Southernblot或Northernblot或直接测序，从而对差异条带鉴定分析，以便最终获得差异表达的目的基因。）获取目的基因方法的选择策略（A、已知mRNA序列或氨基酸序列--逆转录PCR或RT-PCR;B、已知DNA中间序列，欲获得两侧序列—反向PCR；C、已知mRNA的3′端序列，获得cDNA末端序列—5’端RACE；D、已知mRNA的5′端序列，获得cDNA末端序列--3’端RACE；E、欲获得组织特异性或诱导特异性差异表达的基因—DDRT-PCR或SSH等；F、欲获得探针或引物—化学合成；G、DNA的一端序列已知，欲获得包含未知序列的完整基因—锚定PCR）第六章DNA重组的操作平末端改进（修饰）后的连接方法（同聚物加尾法；衔接物(linker)连接法；接头(adapter)连接法）感受态细胞（competentcells）指处于能摄取外界DNA分子的生理状态的细胞。重组DNA导人大肠杆菌的方法化学转化法（氯化钙诱导转化法）的可能机制（在0℃的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，Ca2＋使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中部分核酸酶解离，诱导形成感受态。此外，Ca2＋能与加入的DNA分子结合，形成抗RNase的羟基-磷酸钙复合物，黏附在胞膜的外表面；42℃热激处理，细胞膜的液晶结构发生扰动，出现间隙，重组质粒进入细菌细胞。再迅速冰浴以降低细胞膜流动性，促进细胞膜愈合。）农杆菌介导转化原理（根癌农杆菌含有Ti质粒，Ti质粒上的T-DNA（transferredDNA）在Vir区（毒性基因区）基因产物的介导下可以插入到植物基因组中，诱导在宿主植物中瘤状物的形成。将目的基因插入到人工改造过的Ti质粒的T-DNA区域，通过农杆菌的转化作用，借助Ti质粒的介导功能，使目的基因进入植物细胞，并将其插入到植物细胞中染色体的DNA上，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。）Ti质粒的图谱区（整个质粒160-240kb，包含四个重要部分：T-DNA区、Vir区、Con区、Ori区。其中T-DNA12-24kb，tms的编码产物负责：合成吲哚乙酸；tmr的编码产物负责：合成植物分裂素；tmt的编码产物负责：合成氨基酸衍生物冠瘿碱。在T-DNA的两端还含有左右2个边界，左边界(leftborder,LB)和右边界(rightborder,RB)是长为25bp的末端重复顺序，在切除及整合过程具有重要意义。毒性基因（vir）：决定土壤农杆菌对植物的感染和T-DNA的转移，进入和整合，使根癌农杆菌表现出毒性。Con区(接合转移编码区)：该区段上存在与细菌间接合转移的有关基因，调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。Ori区(originofreplication，复制起始区)：Ori区上的基因调控Ti质粒的自我复制。）重组体导入植物细胞的主要方法简述抗药性标记插入失活选择法筛选重组子的原理简述蓝白斑筛选检测法筛选重组子的原理简述DNA电泳检测法筛选重组子的原理简述核酸杂交（Southernblot）检测法筛选重组子的原理重组子的筛选途径（（1）载体表型筛选或遗传标记筛选（主要是抗药性标记插入失活选择法和蓝白斑筛选）；（2）结构分析筛选（包括凝胶电泳法、酶切法和PCR扩增法）；（3）免疫学筛选（主要是放射性抗体检测法和免疫沉淀检测法）；（4）核酸杂交筛选（主要是菌落原位杂交法、Southern、Northern和western杂交）。）总结筛选重组体的主要方法及原理。