基因扩增(PCR)实验室

基因扩增（PCR）实验室辽阳鑫宇实验室设备安装工程有限公司技术部-2-前言基因扩增检验实验室一文，是根据国家有关法律、法规和技术规范，进行选编、择录和收集有关资料、文章而编写的。选编和择录有关技术规范等，如有错误是编著人理解有误，编者表示歉意。本文的平面图由黄海江、效果图赵玉、录入周悦同志完成。柏松枫、何兴福、张璐、张伟卓、赵馨、赵俨、熊洁萌等编写。陈洪柱参与校对。总经理郎宪明（高级工程师）编导。本文为内部参阅资料，仅供参考。2015年2月-3-基因扩增（PCR）实验室基因扩增检验方法（简称PCR）灵敏度高、特异性强、精确快捷、适用范围广等特点。在生物学、医学科学研究、转基因产品、临床检测、疾病与动物疫病预防和控制、公安侦查等相关专业和学科广为应用。但是，PCR检验实验室应用时需保证实验安全、设置合理的实验室、规范的操作程序和严格的管理制度。近几年，对PCR实验室建设越来越得到重视，因为对检测结果的可靠性、准确性和安全性起到至关重要作用，PCR实验室设计核心问题是如何避免污染。实验室的平面布局、空调通风系统运行、气流控制等都是围绕防止污染这个核心进行设计和建设。1.PCR实验室组合形式PCR实验室可以是分散形式，也可以是组合形式，现在主要是以组合形式为主。1.1分散形式PCR实验室各功能区间分散，又有一定的间距，不会造成区间干扰，因此没有特定要求。由于工作流程的不便利，在新组建的PCR实验室时往往不被采用。1.2组合形式PCR实验室在较大空间实验用房相邻布置依次划分各功能区域，形成一个组合形式完成基因扩增分析的PCR实验室，各区间在物理空间上完全相-4-互独立，各区间无论是在空间还是在使用中，始终处于完全的分隔状态。但是，各实验区间集中布置，容易造成相互干扰，因此对总体布局以及屏障系统具有一定要求。对实验室的空调通风系统、气流流向、大气压力、人物流程等方面，在实验室设计和装修上需进行合理考虑。2.PCR实验室的区域设计2.1PCR实验室分区PCR实验室可分两个工作区域：核酸扩增前区和核酸扩增后区。核酸扩增前区包括试剂准备区和样品处理区，设在不同房间或区域；核酸扩增后区包括扩增区和产物分析区，设在不同房间或区域。2.1.1PCR实验室根据使用仪器的功能合理设置各个区域，如采用聚合酶联反应：则设置试剂储存和准备区、标本制备区、扩增区、扩增产物分析区四个单独的工作区域。样品需要粉碎处理的，还需增设样品粉碎区；若使用实时荧光PCR法：基因扩增区、基因产物分析区可以合并；采用标本处理、核酸提取及扩增检测为一体的全自动化PCR分析仪，则标本制备区、扩增区、扩增产物分析区可合并为一个区域，因此PCR实验室原则上设置五个区或四个区或三个区或二个单独的工作区。2.1.2核酸扩增前区和核酸扩增后区可设在一个房间内，但必须在满足下列要求的前提下：2.1.2.1核酸扩增前区实验室内设置两个不同位置的实验区，试剂配置在超净工作台中操作，样品处理在生物安全柜内操作。2.1.2.2在核酸扩增后区使用全封闭的扩增和检测系统时，如-5-实时荧光PCR仪等。2.1.2.3每个实验人员使用各自的试剂、耗材、移液器和盛放污染物的盛器。2.1.2.4在实验前后对操作区域和共享器具进行清洁及消毒。2.1.2.5各区域的试剂、器具、仪器和设备为该区专用，不得交叉使用。2.2PCR实验室各区域功能：2.2.1试剂储存和准备区：扩增试剂的制备、试剂的分装和扩增反应混合液的制备以及离心管、吸头等消耗品的储存和准备。2.2.2标本制备区：样品登记、处理和分装；核酸（RNA/DNA）提取、保存和使用；PCR扩增的第一轮加样。对于涉及样本的操作应符合生物安全二级实验室防护标准或更高。2.2.3基因扩增区：cDNA合成和DNA扩增。如果在此区进行套式PCR的第二轮加样，应在PCR防护罩内进行。2.2.4扩增产物分析区：扩增产物的电泳、杂交、成像、序列测定、变性高效液相分析、结果分析、登记及报告。2.3工作区域设备和仪器的配置。2.3.1试剂储存和准备区2-8℃和-20℃以下的冰箱、普通离心机、超净工作台、混匀器、微量加样器（覆盖0.2-1000μL），消耗品（一次性手套、耐高压处理的离心管和加样吸头）、专用工作服工作鞋（套）、专用办公用品和废弃物容器、可移动紫外线灯。-6-2.3.2标本制备区2-8℃冰箱、-20℃（或-80℃）冰箱，生物安全柜、高速制冷离心机（台式）、混匀器、恒温水浴箱或加热模块、制冰器或制冷模块、微量加样器、消耗品（一次性手套、耐高压处理的离心管和加样吸头）、专用工作服工作鞋（套）、上下水设备、专用办公用品和废弃物容器、紫外线杀菌灯。如需处理大分子的DNA应具有超声波水浴仪。2.3.3扩增区核酸扩增仪、微量加样器、消耗品（一次性手套、耐高压处理的离心管和加样吸头）、专用工作服工作鞋（套）、专用办公用品和废弃物容器、紫外线杀菌灯。2.3.4扩增产物分析区视检验方法不同而定，基本配置如下：电泳仪、电泳槽、摄影/像设备、变性高效液相分析仪、测序仪、紫外透射仪、普通冰箱、离心机、恒温水浴、微波炉、上下水设备、紫外线灯、微量加样器、消耗品（一次性手套、耐高压处理的离心管和加样吸头）、专用工作服工作鞋（套）、专用办公用品和废弃物容器。各区域设备和仪器的配备，应根据使用的扩增检测技术或试剂特点，对设备和仪器进行必要的增减。2.4PCR实验室单向流流向制度2.4.1实验室的空气单向流流向应该为：试剂储存和准备区→样品制备区→扩增区→扩增产物分析区，不得逆向流动。扩增前区保-7-持微（弱）正压状态，扩增后区保持微（弱）负压状态。2.4.2实验用品单向流工作流向应该为：试剂储存和准备区→样品制备区→扩增区→扩增产物分析区，不得逆向进行。实验用品包括实验材料（试剂、样品和扩增产物）、实验器材（容器、板架、实验服装、帽子、口罩、手套、鞋套）、办公用品（记录纸、笔）、以及清洁工具等。物品的传送是通过互锁式传递窗传递。2.4.3实验人员单向工作流流向应该为：进入各工作区域严格按照试剂储存和准备区→样品制备区→扩增区→扩增产物分析区单一方向进行，不得逆向走动。原则上实验人员应在扩增后区工作后当天不得再返回扩增前区工作。在标本制备区由于加样的操作中可能会发生气溶胶污染，所以应避免或减少在本区内不必要的走动。2.4.4实验室的单向清洁流流向应当为：试剂储存和准备区→样品制备区→扩增区→扩增产物分析区的方向进行。不同的实验区域应当有各自的清洁用具，以防止交叉污染。2.5PCR实验室工作基本原则和实验室各区域工作注意事项2.5.1严格的实验室分区制度；各区域必须有明确的标记，只用于特定的操作，不得从事其他工作；不同区域的设备物品（仪器、设备、材料、清洁工具），不得交叉使用。2.5.2不同工作区域使用不同工作服（例如不同颜色），工作人员离开工作区域时，不得将工作服带出。2.5.3实验前移入所需试剂、耗材、样品以及盛放污染物的容器。-8-2.5.4试剂储存和准备区：储存试剂和用于标本制备的消耗品等材料须直接运送至本区，不能经过扩增检测区。试剂盒中的阳性对照品及质控品不能保存在本区，应当保存在标本制备区。2.5.5标本制备区：由于在样品混合、核酸纯化过程中可能会发生气溶胶所致污染，可通过在本区内设正压条件，避免从邻近区域进入本区的气溶胶污染。为避免标本间的交叉污染，加入待测核酸后，必须盖好含反应混合液的反应管。对具有潜在传染危险性的材料，必须在生物安全柜内操做，并有明确的标本处理和灭活程序。2.5.6扩增区：为避免气溶胶所致的污染，应当尽量避免或减少本区内的人员不必要的走动。必须注意所有经过检测的反应管不得在本区内打开。2.5.7扩增产物分析区：核酸扩增后产物的分析方法较多，如膜上或微孔板或芯片上探针杂交方法（放射性核素标记或非放射性核素标记）直接或酶切后琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳southern转移、核酸测序方法、质谱分析等。本区是最主要的扩增产物污染来源，因此，必须注意避免通过本区物品及工作服将扩增物带出。在使用PCR-ELISA方法检测扩增产物时，必须使用洗板机洗板，废液必须收集在1moL/LHCL中，不能在实验室内倾倒，应当远离PCR实验室的地方弃掉。用过的吸头也必须放在1moL/LHCL中侵泡后再放到废弃物容器或垃圾袋中按程序处理。2.5.8工作结束过后，须对工作区进行清洁处理：对工作区域的实验台面进行清洁消毒（如使用次氯酸钠），实验台面采用紫外线-9-照射更为方便、效果更佳。由于紫外线照射的距离和能量对于去污的效果非常关键，可使用移动紫外线灯（254nm波长），在工作完成后调至实验台面上60-90cm范围内照射。由于扩增产物仅几百和几十碱基对(bp),对紫外线损伤不敏感，因此紫外线照射扩增片段必须延长照射时间，最好是照射过夜。由于本区有可能会用到某些可致基因突变和有毒物质，如溴化乙锭、丙烯酰胺、甲醛或放射性核素等，故应当注意实验人员的安全防护。3.PCR实验室建设与装修3.1根据使用采用仪器的不同确定五个或四个或三个或二个区域，各区域必须设置缓冲间，缓冲间宜设正压，使室内空气不流向室外，室外空气不流向室内，以减少室内外空气交换。也可设专用走廊，但缓冲间比专用走廊更为重要。3.2PCR实验室空气流向，可按照试剂储备和准备区→标本制备区→扩增区→扩增产物分析区方向进行空气压力递减方式控制气流流向，防止扩增产物顺空气气流逆向进入扩增前的区域。也可通过负压排风装置、排风扇或其它可行的方式进行。3.3压差与净化级别3.3.1试剂贮存和准备区、样品处理区应设微正压，以防止外界核酸气溶胶的进入，造成污染，可以通过空气进风风量的大于排风量达到正压效果。3.3.2核酸扩增区、产物分析区应设微负压，防止含核酸的气-10-溶胶扩散出去而污染试剂与样品，造成假阳性结果，可以通过控制排风风量大于进风风量达到负压效果。3.3.3PCR实验室并没有严格的净化要求，若需要一般采用净化级别8或9级（即万级或十万级）。3.4PCR实验室空调通风系统及压力控制为避免各个实验区域间交叉感染的可能性，宜采用全送全排的气流组织形式。同时要严格控制送排风的比例，以保证各实验区的压力要求。3.4.1试剂储存和准备区：因为该区主要进行的操作为储存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备，对于气流压力的控制，本区没有严格要求，但宜采用微正压。3.4.2标本制备区：该区域主要进行的操作为标本的保存、核酸（RNA、DNA）提取、储存即加入至扩增反应管和测定RNA和DNA的合成体。本区的压力梯度要求与相对相邻近区域为正压，是为避免从邻近区进入本区气溶胶污染。3.4.3扩增区：扩增反应混合物配制和扩增反应，该区域主要进行的操作为DNA和CDNA扩增。此外，已制备的DNA模板和合成的CDNA（来自标本制备区）的加入和主反应混合液（来自试剂储存和制备区）制备成反应混合液等也可在本区内进行。在巢式PCR测试中，通常在第一轮扩增后必须打开反应管，因为巢式扩增有较高的危险性，第二次加样必须在本区内进行。因此，本区压力梯度要求为相对邻近区域为负压，以避免气溶胶从本区泻出。-11-3.4.4扩增产物分析区：该区域主要进行的操作为扩增片段的测定（根据所使用的分析仪器的不同此区域与扩增区可以合并为一个区），本区是主要扩增产物污染来源，因此对本区域的压力梯度要求相对于邻近区域应为负压，以避免扩增产物从本区域扩散至其他区域。4.PCR实验室污染的预防与控制PCR实验室设计的核心问题是如何避免实验室污染。常见的污染有以下几种：天然基因组DNA的污染、试剂的污染以及标本间（样品）的污染。由于一旦发生污染，实验就必须停止，直至查到污染源为止，而且实验结果必须作废，需重新进行实验，不仅浪费人力、物力，而且也延长了实验结果的报告时间。实验室一旦发生污染，寻查污染源是一件很繁琐的事情，因此要避免污染，首先是预防污染的发生，而不是发生了再研究如何排除。避免污染的发生，应注意：4.1工作区域的严格划分4.1.1各个区域的合理设置4.1.2各个试验区域须有明显的标记（