基因工程复习题

基因工程复习题2015年5月14号江山整理基因工程复习资料第一章绪论基因工程是通过基因操作，将目的基因或DNA片段与合适的载体连接转入目标生物细胞，通过复制、转录、翻译外源目的基因以及蛋白质的活性表达，使转基因生物获得新的遗传形状的操作。基因工程流程：（1）目的基因克隆（2）载体的准备（3）目的基因与载体连接（4）重组DNA的转化/转染/转导（5）重组体的筛选与鉴定（6）重组体的大量培养，外源基因表达效应分析与开发应用第二章基因工程的酶学基础限制性内切核酸酶的类型：特性Ⅰ型Ⅱ型限制和修饰活性双功能酶内切核酸酶和甲基转移酶分开酶蛋白分子组成3种不同亚基单一亚基限制作用所需辅ATP、Mg2+、S-腺苷镁离子助因子甲硫氨酸特异性识别位点非对称序列回文对称结构切割位点在识别位点至1kb识别位点上处随机切割序列特异性切割否是甲基化作用位点寄主特异性位点寄主特异性位点识别未甲基化序能能列并切割分子克隆中应用无广泛Ⅰ型酶：能识别专一的核苷酸序列，并在识别位点附近切割，切割是随机的Ⅱ型酶：能识别专一的核苷酸序列，并在识别序列的固定位置上切割双链DNA分子。（分子剪刀）2.Ⅱ型限制性内切核酸酶的基本特性（1）识别序列的特异性识别长度为4——6bp,双重旋转对称结构的回文序列（2）切割位点的特异性①.DNA分子酶切片段的末端A黏性末端DNA分子在酶切后形成的具有互补碱基的单链延伸形成的末端结构B平末端若限制性内切酶在识别序列的对称轴上切割，形成的片段末端为平末端。②同切点酶又称同裂酶，是一类来源不同的微生物、能识别相同靶序列的限制性内切酶。③同尾酶来源各异，识别序列页各不相同，但切割后能产生相同的黏性末端3.影响限制性内切酶活性的因素：答：（1）酶的纯度（2）DNA样品纯度（3）DNA甲基化程度（4）酶切反应温度（5）DNA分子的构型（6）反应缓冲液（7）酶的星号活性4.DNA连接酶的发现答：DNA连接酶是能催化双链DNA片段靠在一起的3︑羟基末端与5︑端磷酸基团末端之间通过形成磷酸二酯键，使两端连接的一种酶。依据反应时所需能量辅助因子的不同分为两类：一类是依赖ATP的DNA连接酶；另一类是依赖NAD+的DNA连接酶。依据其来源可分为三类：T4噬菌体DNA连接酶、大肠杆菌DNA连接酶（75kb肽链）、热稳定DNA连接酶。5.DNA连接酶特点T4DNA连接酶是由487个氨基酸组成的多肽单体大肠杆菌DNA连接酶是一条相对分子质量为75000的多肽链，由lig编码.DNA连接酶催化的连接反应特点是：6.DNA连接酶的作用机理答：DNA连接酶是利用ATP或NAD+提供的能量催化DNA双链间缺口形成磷酸二脂键，连接反应的机理如下在连接反应中，首先ATP（NAD+）与DNA连接酶反应，与连接酶生成一种一种共价结合的酶-AMP复合物。其中，AMP通过一种磷酸酰胺键与DNA连接酶的赖氨酸残基的ε-氨基相连，同时释放ppi或烟酰单核苷酸。AMP激活DNA一条链的5︑末端磷酸基团并转移到磷酸基团上，形成DNA——腺苷一磷酸复合物。最后，3︑-OH对激活的磷原子进行亲核攻击，形成磷酸二酯键，同时释放出AMP。在行成酶—腺苷酸复合体时，焦磷酸水解和释放提供的能量驱动连接反应，因此在以ATP作为能源的连接酶中，一个磷酸二脂键的形成消耗两个高能磷酸键。7.影响连接反应的因素答：反应温度：黏性末端一般为4-15℃，平末端为10-20℃。•连接酶浓度：平末端连接的最适酶量约为1-2个Weiss单位(P24)，而黏性末端在同样条件只要0.1个单位，连接时间为16℃、4h或4℃过夜。•ATP浓度：最适终浓度一般为0.5mmol/L。•DNA片段末端：插入片段与载体的浓度比例为10-20，增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。8.DNA聚合酶是指在引物和模板的存在下，将dNTP连续地加到双链DNA分子引物链的3’-OH末端，催化核苷酸聚合作用的酶。类型：依赖于DNA的DNA聚合酶和依赖于RNA的DNA聚合酶。9.(一)大肠杆菌DNA聚合酶ⅠP25-26E.coli3种类型的DNA聚合酶：DNA聚合酶Ⅰ(DNAPolⅠ)、DNA聚合酶Ⅱ(DNAPolⅡ)、DNA聚合酶Ⅲ(DNAPolⅢ)•DNA聚合酶Ⅰ是A.Kornberg等于1956年首次在E.coli中发现的，它是由polA基因编码的一种单链多肽蛋白质。10.Klenow片段P27E.coliDNA聚合酶Ⅰ被蛋白酶切割成两个大小不同的片段，其中小片段具5’→3’外切酶活性，大片段具5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性，称为E.coliDNA聚合酶Ⅰ大片段或Klenow片段。Klenow片段的主要用途：（1）补平经限制性内切酶切后形成的3’凹陷末端（2）：DNA3’末端标记：在3’凹陷末端加上32P放射性标记的dNTP（3）：用于Sanger双脱氧末端终止法进行DNA序列分析（4）：在cDNA克隆，用于cDNA第二链的合成（5）合成杂交探针和进行体外突变：在单链模板上延伸寡核苷酸引物10.T4DNA聚合酶Kienow片段的加强版11.TaqDNA聚合酶来源：从耐热细胞中纯化，已有基因工程酶多种。结构：单亚基，相对分子量为94000。特点：75-80℃，每个酶分子每秒钟可延伸约150个核苷酸，半衰期，94℃反应40min；92.5℃130min；需要镁离子，氯化镁为2M，酶活性最大活性：聚合最适温度为75-80℃，不具3’→5’外切酶活性，具5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性。用途：PCR反应；测序，高温下进行DNA合成可减少模板二级结构。12.反转录酶答：在分子克隆中，主要用于：（1）以mRNA为模板合成其互补的DNA(cDNA)，用于构建cDNA和基因克隆；对具5’端突出的DNA片段的3’凹端进行补平和标记，制备杂交探针；代替Klenow片段或测序酶，用于DNA序列分析。13.末端脱氧核苷酸转移酶。答：主要用途（1）用于克隆DNA片段，给载体和外源DNA3’末端分别加上互补的同聚物尾巴，以便二者在体外连接。（2）用于DNA片段3’末端标记，催化[α-32P]-3’脱氧核苷酸标记DNA片断的3’末端；催化生物素等非放射性的标记物掺入到DNA片断的3’-末端。（3）按照模板合成多聚核糖核苷同聚物。14.RNA酶的用途答：（1）能特异地内切降解DNA:RNA杂合链中的RNA部分，产生不同长度的具有3’-OH和5’-P末端的寡核苷酸。（2）降解DNA制备物中的RNA分子；（3）确定DNA或RNA中单碱基突变的位置第三章载体1.质粒的基本性质答：复制质粒DNA携带有自己的复制起始区以及与此相关的顺式作用元件不相容性两种质粒在同一宿主中不能共存的现象，这就是所谓的质粒不相容性。2.质粒的转移性答接合性质粒含有tra基因，指令宿主细胞与受体细胞结合，使质粒转移。非结合型不含tra基因，但含有bom位点（oriT位点），当宿主细胞内同时存在含有mob基因辅助质粒时，mob的产物可打开非结合型质粒的oriT位点，借助结合型质粒tra基因产物，使非结合型质粒被动迁移到受体细胞中，称为迁移作用。3.质粒载体的构建答：人工改造主要几方面（1）选择合适的复制起始位点变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝（2）加入合适的选择标记基因如两个以上，易于用作选择（3）增加或将少酶切位点便于重组（4）缩短长度切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量4.pBR322质粒载体5.表达载体是可携带DNA片段进入宿主细胞进行复制并进行转录、翻译的载体。一般在克隆载体基础上增加了基因表达的调控原件。可分为质粒表达载体、病毒表达载体、人工染色体和可转移表达载体等。6.原核表达载体的表达原件？答：（1）启动子乳糖操纵子中lac启动子的转录可通过CAP和cAMP来激活（2）转录终止子（3）核糖体结合位点表达方式包括：组成型表达诱导型表达融合型表达分泌型表达7.Ti质粒的结构答：四个功能区T-DNA区Ti质粒中能转移到植物细胞内的区域，称为T-DNA，其左右边界各有一个25bp长的正向重复序列（LTS和RTS），在不同的Ti质粒上高度保守。Vir区位于T-DNA区的上游，其表达产物可激活T-DNA向植物细胞转移，这一个区域也称为致病区。Con区该区含有与农杆菌之间结合转移有关的基因（tra）,这些基因受宿主细胞合成的冠瘿碱激活，使Ti在细菌间转移。Ori区调控Ti质粒的自我复制，为复制起始区。8.双元载体主要功能是？答：表达毒蛋白激活T-DNA转移，也称为辅助Ti质粒。9.基因定点插入/基因敲除载体基因定点插入/基因敲除是通过外源基因与靶细胞基因组DNA的同源序列间的同源重组，将外源基因定点整合到靶细胞特定位置上，使某一位点上的基因发生定点突变技术。10.利用转座子可以构建微生物和植物插入突变载体11.双链RNA对基因表达的阻断作用被称为RNA干扰。（RNAi）RNAi是一个依赖ATP的过程VIGS载体病毒诱导的基因沉默是利用植物体内天然存在的免疫机制，将目的基因片段构建到病毒载体中并用病毒侵染寄主植物，目的基因作为病毒的一部分同病毒一起复制并扩散到整个植株，植物体的防御机制被病毒激活后，在识别病毒和目的基因的同时，将内院的目的基因mRNA降解，从而达到基因沉默的目的。第三章基因工程的主要技术及其原理1.DNA提取的基本原理DNA特点：DNA是极性化合物，溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂。它的钠盐比游离态更易溶于水，DNA在水溶液中的溶解度可达10g/L,呈粘性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。DNA在盐溶液中的溶解度随着盐浓度的增加而增加。DNA提取基本步骤：a细胞裂解和DNA的溶解一般采用机械破碎细胞（或酶解细胞）释放DNA采取措施：⑴利用液氮研磨，使酶失活；⑵快速加入缓冲液并迅速混匀，对细胞溶浆中DNA进行保护。EDTA—螯合DNA酶的辅助因子Mg2+和Ca2+,使DNA酶活性降低；SDS—使蛋白质变性并降解蛋白质，也可降低DNA酶的活性；抗氧化剂—降低酚类氧化对DNA的干扰；PVP—与多酚形成复杂的聚合体，与多糖结合，有效去除多糖；b.与核酸结合的蛋白质及RNA等杂质的去除；主要利用DNA与蛋白质、多糖等在生化性质上的差别，通过加入离子变性剂，去污剂使蛋白质或多糖变性，核蛋白解聚。CTAB十六烷基三甲基溴化铵溶解细胞膜在高盐溶液中与DNA结合成复合物并呈溶解状态SDS十二烷基磺酸钠使蛋白质变性除蛋白质氯仿/异戊醇抽提（氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离；异戊醇则有助于消除抽提过程中出现的气泡）。使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等）高盐洗涤(当溶液中的中性盐的浓度大于1mol/L时，蛋白质会沉淀析出.)蛋白酶处理必要时加不含DNA酶的RNA酶以除去RNA的污染C.DNA的沉淀和纯化将上述溶解在上清液中的DNA加入2倍体积的无水乙醇可使其沉淀，75%的乙醇清洗除各种离子，沉淀DNA溶于TE中，或将沉淀缓冲液透析除去去垢剂和有机溶剂。2.DNA抽提的几种方法？答：（1）浓盐法利用RNA和DNA在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，（2）SDS法将生物细胞破碎后，加入SDS使细胞膜裂解，并同时使蛋白质和多糖等杂质与DNA分开。（3）CTAB法（十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。（4）苯酚抽提法蛋白质变性，抑制DNA酶降解作用。（5）水抽提法利用核酸溶解于水的性质，将组织细胞破碎后，用低盐溶液除去RNA，然后将沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水中，离心后收集上清液。3.质粒提取也可以采用试剂盒进行。4.RNA提取的4个关键点：答：（1）细胞的有效破碎，尤其是植物细胞有厚厚的细胞壁保护，研磨需测底：（2）使核蛋白复合体充分变性、解离，使核酸释放到溶液中。（3）有效的抑制内源及外源RNase活性（加入异硫氰酸胍）（4）将RNA与蛋白质、DNA、多糖分开5.总RNA提取的方法答：（1）酚-异硫氰酸胍提取法（2）离心提取法6.DNA或RNA浓度、纯度和相对分子质量